Абстрактный
Предыстория: Появляются новые данные, свидетельствующие о том, что клеточные АФК, включая оксид азота (NO), являются важными медиаторами воспаления и остеоартрита (ОА). Было продемонстрировано, что водорастворимая полигидроксилированная наночастица фуллерена С60 (фуллерола) обладает выдающейся способностью поглощать АФК.

Цель: Целью данного исследования является оценка влияния фуллерола на воспаление и ОА с помощью исследований in vitro и in vivo.

Методы: В экспериментах in vitro первичные перитонеальные макрофаги мыши и клеточную линию макрофагов RAW264.7 стимулировали к воспалительным фенотипам липополисахаридом (LPS) в присутствии фуллерола. Для исследования на животных модель ОА была создана путем внутрисуставной инъекции монойодоацетата в коленные суставы крыс, а фуллерол вводили внутривенно сразу после индукции ОА.

Результаты: Фуллерол значительно снижал продукцию NO и экспрессию провоспалительных генов, индуцированных LPS, в клетках обоих типов макрофагов. Между тем, фуллерол может значительно снижать фосфорилирование протеинкиназы, активируемой митогеном р38, и уровень белка факторов транскрипции nuclear factor-kappaB и транскрипционного фактора forkhead box 1 в ядре. Исследование на животных показало, что систематическое введение фуллерола предотвращает ОА, подавляя воспаление синовиальных оболочек и повреждение хрящевых хондроцитов в суставах с ОА.

Заключение: Антиоксидантный фуллерол может иметь потенциальное терапевтическое применение при ОА.

Ключевые слова: макрофаги, воспаление, остеоартрит, антиоксидант, полигидроксилированный фуллерен С60

Вступление
Остеоартрит (ОА) - это изнурительное заболевание, характеризующееся дегенеративными изменениями в суставном хряще, кости и других окружающих тканях. Классическое определение ОА как хронического невоспалительного заболевания, которое недавно перешло в воспалительное заболевание, основанное на спектре между нормальным контролем и ревматоидным артритом (РА), воспалительным заболеванием суставов, часто изучаемым и характеризуемым в сравнении с ОА.1 Недавние исследования установили, что компоненты обоих врожденная и адаптивная иммунные системы, включая различные типы клеток, цитокины, хемокины и комплементы, играют решающую роль в патогенезе ОА.2 Эти компоненты действуют согласованно на ранней стадии ОА. В связи с этим активированные макрофаги являются основными клетками и ключевыми участниками этих ранних событий и, следовательно, стали многообещающей мишенью для лечения ОА.2

Фуллерен (С60) и его производные обладают уникальной структурой, которая состоит из 60 атомов углерода, образующих полую сферу диаметром около 1 нм.3 Были исследованы различные их эффекты, такие как ингибирование ферментов, фотоиндуцированное повреждение молекул ДНК, клеточных мембран и самих клеток, микробная и вирусная инактивация и антиокисление. Среди этих эффектов свойства по удалению свободных радикалов и подавлению оксида азота нашли применение в области биомедицины. Способные обратимо восстанавливаться до 6 электронов и с добавлением до 34 метильных радикалов к сфере C60, фуллерены были охарактеризованы как “губки–радикалы”.4-6 Производные фуллерена, которые были исследованы на предмет антиоксидантных свойств и способности защищать клетки, включают фуллерол (полигидроксилированный фуллерен), карбоксифуллерен, фуллерен-содержащий аминокислоты и пептиды.6

Фуллерол - это водорастворимое производное фуллерена, которое, как было продемонстрировано, действует как мощный антиоксидант в различных типах клеток и тканей.6 Мы предположили, что это может снизить уровень окисления и воспалительные фенотипы стимулированных макрофагов и, следовательно, облегчить симптомы ОА. Чтобы проверить эту гипотезу, мы здесь определили биологическую активность фуллерола в отношении первичных перитонеальных макрофагов мыши и клеточной линии макрофагов RAW264.7, а также его влияние на воспаление синовиальных оболочек и повреждение хондроцитов хряща в экспериментальной модели ОА коленного сустава крысы.

Воспалительная реакция была тщательно изучена с помощью стимулированных липополисахаридом (LPS) необработанных клеток макрофагов 264,7. Сообщалось, что ЛПС активирует множественные внутриклеточные сигнальные пути, вовлекающие активные формы кислорода (АФК).7,8 Связываясь с toll-подобным рецептором 4 (TLR4) на поверхности макрофагов, ЛПС индуцирует выработку АФК, что приводит к стимуляции митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) и про-факторы транскрипции воспаления, такие как ядерный фактор-kappaB (NFkB) и фактор транскрипции форкхед-бокса 1 (FoxO1).7,8 Активация NFkB и FoxO1 впоследствии приводит к повышенной экспрессии маркеров воспаления, включая фактор некроза опухоли-альфа (TNFα), IL-1β, IL-6, индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS) и выработка оксида азота (NO), которые тесно связаны с инициацией и прогрессированием ОА.7-9 Кроме того, передача сигналов p38 MAPK играет важную роль в регуляции воспалительных реакций.10 Таким образом, влияние фуллерола на киназу p38 MAPK и факторы транскрипции NFkB и FoxO1, а также TLR4 было оценено в клеточной линии макрофагов RAW264.


Материалы и методы
Культивирование клеток и лечение
Первичные перитонеальные макрофаги выделяли из брюшины мыши C57/BL6 и культивировали в DMEM (Gibco BRL, Гейтерсберг, Мэриленд, США) с добавлением 10% FBS (Hyclone Laboratories, Логан, Вирджиния, США) и 100 МЕ/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина во влажной атмосфере 5% углекислого газа при температуре 37°C. Клеточную линию макрофагов мыши RAW264.7 (ATCC, Манассас, Вирджиния, США) поддерживали в той же питательной среде. Для лечения клеток используется фуллерол (также называемый полигидроксифуллерен или фуллеренол с формулой C60 (OH)24; MER Corporation, Тусон, Аризона, США) добавляли в культуру за 0,5 часа до добавления 100 нг/мл LPS (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури, США), а затем клетки совместно обрабатывали LPS в течение 4 часов для первичных макрофагов или 24 часов для RAW264.7 макрофагов.

Анализ экспрессии генов
Суммарную РНК экстрагировали и очищали с помощью набора RNeasy (QIAGEN Sciences, Валенсия, Калифорния, США) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Днказа, не содержащая РНКазы, используется для расщепления ДНК во время очистки РНК. Очищенную РНК хранили при температуре -80°C. Выход РНК определяли путем измерения поглощения при 260 нм. Синтез кДНК из общей РНК и количественную ПЦР проводили с использованием набора для синтеза КДНК iscript ™ и набора iQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США), соответственно. Гены-мишени включали iNOS, TNF-α, IL-1β и IL-6. Ген 18s рибосомальной РНК использовали в качестве внутреннего контроля. Значение порогового цикла (CT) рассчитывали по графикам амплификации. Данные анализировали с использованием метода 2−∆∆CT с использованием 18s рРНК в качестве эталона.Экспрессия 11 генов была нормализована по отношению к контрольной группе в каждом эксперименте и представлена в виде кратности изменения. В последовательности праймеров перечислены следующим образом: 5ʹ-GTGACCAGTTCACTCTTGGT-3ʹ (вперед), 5ʹ-CATTG-GAAGTGAAGCGTTTCG-3ʹ (реверс) для 18С рРНК, 5ʹ-GAGGGATGCCTTCCGCAGCTG-3ʹ (вперед), 5ʹ- "ГААТ" -CGAACCCTGATTCCCCGTC-3ʹ (реверс) для инос, 5ʹ-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3ʹ (вперед), 5ʹ-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3ʹ (реверс) фактора некроза опухоли α, 5ʹ-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3ʹ (вперед), 5ʹ-GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3ʹ (реверс) для Ил-1β и 5ʹ-GAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3ʹ (вперед), 5ʹ-TGGTCTTGGTCCTTAGCC-3ʹ (реверс) для ИЛ-6.

Вестерн-блоттинг-анализ
Цитоплазматические и ядерные белки были получены из клеток, растущих на 6-луночном планшете (приблизительно 500 000 на лунку), с использованием набора для экстракции ядра и цитоплазмы (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Затем концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Bradford (Bio-Rad Laboratories). Образцы, содержащие 100 мкг белков, обрабатывали 10%-ным SDS-полиакриламидным гелем при постоянном токе 80 В и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Thermo Scientific) при постоянном напряжении 10 В в течение ночи. Мембраны блокировали 5%-ной фракцией V BSA, не содержащей жирных кислот (Roche Diagnostics, Индианаполис, штат Индиана, США) в растворе TBST (50 мм Tris, рН 7,6, 150 мм NaCl, 0,05% Tween 20) в течение 1 часа при комнатной температуре (RT), промывали и инкубировали в течение ночи при 4°CC в 5% растворе BSA в TBST, содержащем каждое из специфических первичных антител против TLR4, p-p38, NFkB P65 (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США), FoxO1 (клеточная сигнализация) и GAPDH (Sigma-Aldrich Co.). Затем мембраны инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) (клеточная сигнализация), в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим смешиванием хемилюминесцентного субстрата для антитела к HRP и раствора усилителя (Thermo Scientific) в соотношении 1:1. Мембраны инкубировали в темноте с авторадиографическими пленками (Genesee Scientific, Сан-Диего, Калифорния, США), и пленки были проявлены для визуализации полос. Затем изображения в оттенках серого (300-400 точек на дюйм) на пленках сканировались с помощью плоского сканера. Денситометрия проводилась в Photoshop. Используя инструмент magic wand из палитры инструментов, была выбрана область каждой полосы, и была записана средняя гистограмма, а затем нанесена на график. Все вестерн-блоты были проведены в трех экземплярах.

Определение уровня TNF α
Количество TNFα измеряли с помощью коммерческого набора для ИФА (Sigma-Aldrich Co.), следуя инструкциям, предоставленным производителем. Вкратце, клетки высевали на 96-луночный планшет и проводили различные обработки. Питательную среду собирали и шаг за шагом смешивали с различными реагентами для анализа. Полученные растворы считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов.

Обнаружение образования нитритов
Система реагентов Грисса основана на химической реакции, в которой используются сульфаниламид и N-1-нафтилэтилендиамин дигидрохлорид (NED) в кислых (фосфорная кислота) условиях. Эта система обнаруживает образование нитритов. В настоящих экспериментах определение оксида азота проводилось с помощью коммерческого набора (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) в соответствии с руководством производителя. Вкратце, все экспериментальные образцы и стандарты, содержащие серию разведений для эталонной кривой нитритного стандарта, смешивали с 50 мкл раствора сульфаниламида и инкубировали 10 минут при комнатной температуре без света в 96-луночном планшете. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора NED и инкубировали 10 минут при комнатной температуре без света. OD определяли при 530 нм на считывателе микропланшетов в течение 30 минут.

Анализ цитотоксичности
Макрофаги в контрольной группе и группах лечения выращивали на 96-луночном планшете, и количество клеток подсчитывали с помощью набора WST-1 (Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). После удаления супернатанта в каждую ячейку добавляли по 150 мкл новой среды. Затем добавляли 15 мкл реагента для пролиферации клеток WST-1 и инкубировали клетки в течение 3 часов в темноте с увлажненной атмосферой, содержащей 5% диоксида углерода, при 37°C. Каждый образец определяли при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов.

Флуоресцентное окрашивание микрофиламента
Клетки, растущие на покровных стеклах, промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 10 минут. Флуоресценцию микрофиламента исследовали с помощью FITC-фаллоидина (Sigma-Aldrich Co.) и наблюдали под конфокальным микроскопом Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss Meditec AG, Йена, Германия).

Эксперимент на животных
Самки/самцы крыс Спраг-Доули в возрасте 12-14 недель были использованы для эксперимента на животных (n=4/группа) с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Вирджинии в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8-е издание Министерства здравоохранения США Служба (2010). Хорошо зарекомендовавшую себя модель ОА коленного сустава крысы индуцировали внутрисуставной инъекцией монойодоацетата (MIA) (2 мг/50 мкл PBS). В группе лечения водный раствор нано-фуллерола (2 мг/кг веса) вводили внутривенно сразу после внутримышечной инъекции. Животных подвергали эвтаназии в назначенные сроки после лечения. Синовиальные оболочки/мыщелки суставов как контрольных, так и поврежденных коленей собирали для гистологического исследования.

Статистический анализ
Данные выражали как среднее значение ± SD. Статистическая оценка проводилась методом ANOVA с использованием программного обеспечения SPSS 15.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Значение P, равное 0,05 или менее, рассматривалось как значимая разница. Для сравнения различий между двумя группами был проведен t-критерий Стьюдента (двухсторонние и равные дисперсии), и P<0,05 был признан значимым.

Результаты
Мышиные первичные перитонеальные макрофаги
Тест WST-1 показал, что фуллерол не оказывал влияния на количество клеток в тестируемых дозах (0, 0.1, 0.3, 1, 3 МКМ) на рисунке 1А, что указывает на отсутствие токсичности в отношении первичных макрофагов при применении в любой дозе ниже 3 мкм. Доза 1 мкм была выбрана для других биологических анализов, включая определение продукции NO, уровня мРНК и продукции воспалительных цитокинов с помощью реактива Грисса, ОТ-ПЦР и ИФА соответственно. Группа LPS (обозначаемая как LPS) имеет более высокий выход NO, чем группа, получавшая no (обозначаемая как NT), или группа LPS в сочетании с фуллеролом (обозначаемая как LPS + FUL) (рис. 1B). Та же закономерность была выявлена в экспрессии генов, связанных с воспалением, iNOS (рис. 1C), TNF α (рис. 1E), IL-1β и IL-6 (рис. 1F), а также в продукции TNF α (рис. 1D).

Клеточная линия макрофагов мыши RAW264.7
Клеточная линия RAW 264.7 была получена из перитонеальных макрофагов и выделена из асцита опухоли, индуцированного у самца мыши внутрибрюшинной инъекцией вируса абселон-лейкоза (A-MuLV). Он широко использовался для исследований воспаления, поскольку его очень легко выращивать и поддерживать в лабораторных условиях. Как и ожидалось, настоящее исследование показало, что биологическая активность фуллерола в клеточной линии макрофагов была аналогична таковой в первичном макрофаге (рис. 2). Во-первых, фуллерол в дозах до 3 мкм не был цитотоксичен по отношению к клеткам RAW267.4, определенным с помощью анализа WST-1 (рис. 2А). Во-вторых, с помощью теста с реактивом Грисса было обнаружено, что фуллерол может противодействовать стимулированной ЛПС выработке NO (рис. 2B). В-третьих, количественный анализ методом ОТ-ПЦР показал, что фуллерол может значительно подавлять индуцированное LPS повышение уровней клеточной мРНК iNOS, TNF α, IL-1β и IL-6 (рис. 2C, , E, E и andF).F). Наконец, с помощью теста ELISA было показано, что фуллерол может ингибировать секрецию TNF α из клеток, обработанных LPS, с ингибирующей активностью, сравнимой с противовоспалительным препаратом дексаметазоном (рис. 2D). Ранее было продемонстрировано, что LPS индуцирует образование многоядерных клеток RAW264.7 посредством слияния клеток и реорганизации микрофиламентов. Кроме того, было обнаружено, что эти многоядерные клетки обладают повышенной активностью фагоцитоза, и их можно было наблюдать с помощью высокоаффинного нитевидного актинового (F-actin) зонда фаллоидина, конъюгированного с FITC с зеленой флуоресценцией.12 Таким образом, мы используем этот метод, чтобы предоставить дополнительные доказательства того, что фуллерол может ингибировать активацию макрофагов ЛПС. Под флуоресцентным микроскопом было очевидно, что фуллерол обращает вспять слияние клеток и реорганизацию микрофиламентов (белые стрелки) в клетках, обработанных LPS (рис. 3А). При подсчете 50 ядер в случайной области количество многоядерных клеток (клеток с 3 или более ядрами) составило 1, 6 и 3 в группе NT, группе LPS и группе LPS + FUL соответственно (рис. 3B). Чтобы исследовать механизмы действия фуллерола, уровень белка как цитоплазматического TLR4, так и ядерного NFkB был проверен методом вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что добавление фуллерола может снизить выработку обеих молекул, стимулируемых LPS (рис. 4А и Б).Б). Кроме того, два важных белка p38 MAPK и FoxO1 были проверены методом вестерн-блоттинга. Результаты показали, что группа LPS в сочетании с фуллеролом имела значительно сниженный цитоплазматический уровень фосфорилированного p38 MAPK (p-p38 MAPK) и ядерное количество FoxO1 по сравнению с группой, принимавшей только LPS (рис. 4C и andD).D). Поскольку было хорошо установлено, что эти белки являются ключевыми молекулами, способствующими воспалению, текущие результаты указывают на то, что фуллерол, вероятно, проявляет свое ингибирование воспаления через задействованные в них сигнальные пути.

Эксперимент на животных
Поскольку синовиальная оболочка является основным очагом воспаления после индукции ОА, мы проверили, может ли фуллерол вызывать гистологические изменения в воспаленной синовиальной оболочке, такие как неоваскуляризация, окрашиваемая окрашиванием H&E. Сообщалось, что фуллерол не проявлял токсичности после внутривенного введения до 10 мг/кг массы тела крысам Спраг-Доули.13 В настоящих пилотных экспериментах на животных фуллерол в дозе 2 мг/кг веса вводили внутривенно сразу после индукции ОА путем внутримышечной инъекции. Как показано на рисунке 5, гистологический анализ продемонстрировал, что лечение фуллеролом в течение 5 дней эффективно уменьшало количество резидентных фибробластоподобных клеток и количество кровеносных сосудов, видимых на изображении вверху/слева в группе MIA/NT, что указывает на облегчение синовиального воспаления. На рисунке 6 видно, что структуры сустава и суставного хряща были разрушены более серьезно на 21-й день, чем на 11-й день после инъекции MIA, и лечение фуллеролом в течение 21 дня могло противодействовать потере матрикса, хондроцитов (черные стрелки) и толщины хряща (черные линии и гистограмма). в бедренном суставном хряще поврежденного сустава. В частности, толщина суставных слоев, выбранных случайным образом в группе PBS, группе MIA и группе MIA + FUL, составила 144 мкм, 62 мкм и 86 мкм соответственно.

Обсуждение
В этом исследовании мы оценили биологическую активность фуллерола в стимулированных LPS первичных перитонеальных макрофагах мыши и клетках макрофагов RAW264.7 путем измерения продукции свободнорадикального продукта нитрита, экспрессии провоспалительных генов и активации специфических внутриклеточных сигнальных молекул. Нитритный тест, ПЦР в реальном времени, ИФА и вестерн-блот анализы показали, что ЛПС может индуцировать воспалительные фенотипы макрофагов, а фуллерол может значительно противодействовать эффектам ЛПС (рисунки 1-4). Кроме того, мы обнаружили, что фуллерол может уменьшать воспаление синовиальной оболочки и дегенерацию хряща при ОА, вызванном MIA (рисунки 5 и and66).

С момента первого синтеза фуллерола четверть века назад появилось множество сообщений о его применении в биологии и медицине благодаря простоте получения и отличным свойствам растворяться в воде.6,14-26 Что касается клеточной линии макрофагов RAW264.7, предыдущее исследование продемонстрировало, что фуллерол в дозах 10-50 мкм может дозозависимо ингибировать выработку АФК, повреждение клеток и снижение мембранного потенциала митохондрий, индуцированное нитропруссидом натрия или перекисью водорода.23 Последовательно, текущее исследование показало, что даже при более низких дозах (1 мкм или менее) фуллерол способен предотвращать образование NO после обработки LPS. Соответственно, фуллерол подавлял стимулированную LPS экспрессию генов, связанных с воспалением, iNOS, TNF-α, IL-1β и IL-6, определяемых методами ОТ-ПЦР и ELISA (рис. 2), а также образование многоядерных макрофагов путем флуоресцентного окрашивания клеточных микрофиламентов с использованием фаллоидина, меченного FITC (Рис. 3). Что еще более важно, противовоспалительная активность первичных перитонеальных макрофагов была дополнительно подтверждена экспериментальными данными об ингибировании фуллеролом продукции как NO, так и провоспалительных цитокинов в присутствии ЛПС (рис. 1).

Было установлено, что внутриклеточные АФК являются ключевыми медиаторами передачи сигнала после стимуляции LPS в клетках RAW264.7.7,8 Связывание LPS с его специфическим рецептором TLR4 запускает ряд биохимических каскадов внутри клеток, включая: 1) перегруженные клеточные АФК, 2) активацию различных MAPK, 3) фосфорилирование различных факторы транскрипции и 4) регуляция экспрессии гена-мишени (рис. 7).7,8 В настоящем исследовании мы впервые обнаружили, что фуллерол эффективно ингибирует фосфорилирование p38 MAPK, ядерная локализация факторов транскрипции NFKB и FoxO1 методом вестерн-блоттинга и уровень мРНК TLR4 методом ОТ-ПЦР (рисунки 3 и and4).4). Основываясь на этих данных, мы предложили предполагаемый механизм, лежащий в основе противовоспалительного действия фуллерола (рис. 7). Интересно, что снижение уровня мРНК iNOS подразумевало, что производные фуллерена, вероятно, подавляли выработку NO не только за счет регуляции ферментативной активности27, но и биосинтеза iNOS, который является ключевым ферментом для выработки NO. Кроме того, результат, связанный с регуляцией FoxO1 и TLR4, подтверждается недавним отчетом, в котором предполагается, что TLR4 был геном-мишенью FoxO1 в клетках RAW264.7, стимулированных LPS.9 Кроме того, предложенный антиоксидантный механизм противовоспалительного действия фуллерола согласуется с предыдущими данными о другие окислители, такие как N-ацетилцистеин, ресвератрол и мальвидин.8,28,29 Однако сложность задействованных сигнальных сетей затрудняла проведение различия между причиной и следствием и идентификацию восходящих и нисходящих событий. В связи с этим подробный механизм в настоящее время далек от полного прояснения, и, по-видимому, в будущем потребуется много исследований.

Модель MIA представляет собой быстро прогрессирующую биохимически индуцированную модель ОА. MIA индуцирует гибель хондроцитов у грызунов и других видов, не относящихся к грызунам, и вызывает потерю суставного хряща с поражениями субхондральной кости, которые имитируют ОА человека. Модель MIA проста в индуцировании, обладает хорошей воспроизводимостью, поэтому часто используется для “доказательства концепции” исследования OA.30-35, в частности, активация макрофагов и повышение уровней NO и провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β и IL-6, в коленных суставах были описаны с использованием этой модели.30,34,35 Обнадеживающие результаты наших экспериментов in vitro позволяют предположить, что фуллерол является эффективным ингибитором воспаления (рисунки 1 и 2)2) и позволил нам провести пилотное исследование для оценки эффективности фуллерола в защите суставов от воспаления и травм при ОА на модели MIA. Действительно, настоящий гистологический анализ показал, что однократная инъекция фуллерола, систематически вводимая крысам, эффективно уменьшала синовиальное воспаление и дегенерацию хряща в коленном суставе крыс с ОА (рисунки 5 и и6).6). Результат соответствует отчетам Yudoh и соавт., описывающих ингибирующие эффекты водорастворимого фуллерена (С60, содержащего поливинилпирролидон) на вызванный хирургическим путем ОА коленных суставов кроликов и вызванный адъювантом РА коленных суставов крыс.36,37 Стоит отметить, что фуллерол (полигидроксилированный С60), используемый в наших экспериментах, отличается от первозданного С60, и приготовление фуллерола намного проще, чем первозданного С60, для биомедицинского применения. Кроме того, модель на животных в нашем исследовании отличается от их, поэтому сравнительное исследование двух препаратов будет более значимым с использованием одной и той же модели на животных.

Различные клеточные АФК, включая NO, особенно повреждают компоненты матрикса суставного хряща путем прямой атаки, снижения синтеза или активации матриксных металлопротеиназ.38,39 Кроме того, АФК могут способствовать деградации хряща, воспалению суставов, апоптозу хондроцитов и изменению редокс-чувствительных внутриклеточных путей.39 Было обнаружено, что повреждающее сжатие суставного хряща является достаточным для возникновения апоптоза хондроцитов, который частично опосредован выработкой АФК.40 АФК вызывают повреждение мембран митохондрий, что приводит к высвобождению каспаз и других проапоптотических молекул.41 Открытие, что фуллерол способен снижать АФК, продуцируемые активными макрофагами (рисунки 1 и 2),2), наряду с нашими опубликованными данными о защите фуллерола от гибели клеток и дегенерации матрикса хондроцитов, индуцированной перекисью водорода и IL-1,20, позволяет предположить, что фуллерол с большей вероятностью улучшает ОА. симптом проявляется в его воздействии как на макрофаги, так и на хондроциты в тканях сустава. Это дополнительно подтверждается экспериментами Yudoh и соавт., показавшими, что протестированный водорастворимый фуллерен может предотвращать вызванное стрессом снижение выработки матрикса, а также апоптоз и преждевременное старение хондроцитов человека.37

В текущем исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, хотя перитонеальные макрофаги грызунов часто применяются для исследований воспалительных заболеваний суставов, это не тот тип клеток, который находится в тканях суставов.42,43 Учитывая, что макрофаги суставов грызунов трудно получить, включение макрофагов из синовиальных тканей пациентов с ОА человека может быть хорошим решением. выбор.36,42 Во-вторых, как упоминалось выше, модель MIA хороша для исследования “доказательства концепции”. Однако ее ограничение очевидно, поскольку прогрессирование ОА в этой модели происходит намного быстрее, чем в модели с хирургическим повреждением, которая ближе имитирует заболевание ОА у человека. Таким образом, оценка фуллерола исследуется в нашей лаборатории с использованием модели ОА, вызванного рассечением передней крестообразной связки.38,44 Кроме того, в настоящих экспериментах фуллерол вводили одновременно с индукцией ОА, и изучалась только профилактическая активность фуллерола. В этом смысле текущие результаты являются очень предварительными, и следует провести дополнительные эксперименты, в ходе которых лечение фуллеролом будет проводиться в разные моменты времени ОА в соответствии с ранее опубликованными аналогичными исследованиями.45 Кроме того, местная инъекция считается предпочтительным способом медикаментозного лечения ОА коленного сустава в клинике.46,47 Внутрисуставное введение должно быть лучшим выбором, чем внутривенная инъекция, для оценки эффективности фуллерола в терапии ОА. Наконец, для подтверждения выводов, полученных в ходе текущего исследования, необходимы более детальное исследование и анализ пути распространения, а также эксперименты на животных.


Вывод
Текущее исследование впервые показывает, что фуллерол может ингибировать воспалительную реакцию, снижая выработку АФК и подавляя экспрессию воспалительных генов, возможно, через пути ROS/p38 MAPK/NFkB и ROS/p38 MAPK/FoxO1. Фуллерол может ингибировать прогрессирование экспериментального ОА у крыс и, таким образом, потенциально может быть использован в качестве нового противовоспалительного препарата для лечения ОА.


Подтверждения
Работа выполнена при поддержке NIH/Национального института артрита, заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи, грант № 5R21AR070987 и исследовательского фонда Медицинской школы Университета Вирджинии.

Раскрытие
QC сообщает о грантах от NIH, Университета Вирджинии и Exactech. Авторы не сообщают о каких-либо других конфликтах интересов в этой работе.