Абстрактный

Биоактивные растворимые углеродные наноструктуры, такие как фуллерен С60, могут связываться до шести электронами, таким образом, являясь мощным поглотителем активных форм кислорода, аналогично многим природным антиоксидантам, широко используемым для уменьшения эффекта мышечной усталости. Цель исследования - определить действие чистого водного коллоидного раствора фуллерена C60 (C60FAS) на восстановление после переутомления m. triceps surae у крыс, находящихся под наркозом.

Результаты
Во время развития утомления мы наблюдали снижение уровня мышечных усилий до введения C60FAS. После применения C60FAS было зафиксировано более медленное снижение усилий с последующим длительным сохранением определенного уровня. Анализ изменений метаболических процессов, сопровождающих мышечную усталость, показал увеличение маркеров окислительного стресса H2o2 (перекись водорода) и TBARS (вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой) по отношению к интактным мышцам. После введения C60FAS содержание TBARS и уровень H2o2 были снижены. Эндогенная антиоксидантная система продемонстрировала аналогичный эффект, поскольку уровень GSH (восстановленного глутатиона) в мышцах и активность фермента CAT (каталазы) повышались во время усталости.

Выводы
C60FAS приводит к сокращению времени восстановления силы мышечного сокращения и увеличению времени активного функционирования мышц до появления устойчивых эффектов усталости. Следовательно, возможно, что C60FAS влияет на гомеостаз прооксидантно-антиоксидантной мышечной ткани, впоследствии повышая мышечную выносливость.

Ключевые слова: фуллерен С60, утомление скелетных мышц, электростимуляция, маркеры окислительного стресса, антиоксидантная система

Усталость скелетных мышц является защитным механизмом от перегрузки и приводит к развитию болезненной чувствительности мышц [1-3]. Мышечная усталость развивается после физических нагрузок различной интенсивности и часто приводит к острой боли, которая затем может привести к различным хроническим болезненным состояниям [4, 5]. Мышечная усталость является результатом продуктов неполного окисления кислорода, таких как активные формы кислорода (АФК), включая пероксиды, свободные радикалы и ионы кислорода [6]. В процессе перекисного окисления липидов ненасыщенные жирные кислоты образуются из различных производных жирных кислот и метаболитов, таких как малоновый диальдегид и гидропероксид жирной кислоты [7]. Чрезмерное накопление АФК (окислительный стресс) может привести к значительным функциональным изменениям из-за повреждения различных компонентов клетки [8]. Примером может служить перекисное окисление липидов биологических мембран, которое способствует нарушению их структуры и повышает их проницаемость [9]. Защита клеток от такого повреждения обеспечивается антиоксидантной системой. Mach et al. [10] использовали пикногенол в качестве антиоксиданта, и его применение сопровождается повышением уровней как окисленного, так и восстановленного NAD+ в сыворотке крови, а также увеличением мышечной силы. В исследованиях мышечной усталости широко используются эндогенные антиоксиданты, такие как N-ацетилцистеин [11] и β-аланин [12], которые ускоряют процесс восстановления мышц после переутомления. В этом контексте биоактивные растворимые углеродные наноструктуры, такие как первозданные фуллерены C60, могут рассматриваться как потенциальные антиоксиданты [13]. Фуллерен С60 легко связывает до шести электронов, может служить мощным поглотителем АФК [13-15] и превосходит большинство природных антиоксидантов, включая витамины С и Е и каротиноиды, по своей антиоксидантной способности. В результате он предотвращает распространение окислительного стресса в тимоцитах [16] и проявляет защитный эффект после ишемически–реперфузионного повреждения скелетных мышц [17]. Кроме того, водорастворимые первозданные фуллерены С60 могут проникать через плазматическую мембрану клеток [18, 19]. Следовательно, использование фуллеренов С60 может оказывать мощное антиоксидантное действие на сократительный аппарат поперечнополосатой мышцы, тем самым способствуя ее функциональному восстановлению после экспериментально вызванного переутомления.

Целью данного исследования было изучение влияния водорастворимых первозданных фуллеренов С60 на динамику восстановления сократительных свойств m. triceps surae крысы (TS) после развития мышечной усталости в условиях длительной активации.

Методы
Подготовка материала и его характеристика
Высокостабильный воспроизводимый первозданный водный коллоидный раствор фуллерена C60 (C60FAS) в концентрации 0,15 мг/мл был приготовлен в соответствии с предыдущим протоколом [20, 21]. Вкратце, для приготовления C60FAS мы использовали насыщенный раствор чистого фуллерена C60 (чистота >99,99%) в толуоле с концентрацией молекулы C60, соответствующей максимальной растворимости около 2,9 мг/мл, и такое же количество дистиллированной воды в открытом стакане. Образовавшиеся две фазы обрабатывали в ультразвуковой ванне. Процедуру продолжали до тех пор, пока толуол полностью не испарился и водная фаза не приобрела желтый цвет. Фильтрация водного раствора позволила отделить продукт от нерастворенных фуллеренов С60. Размер пор фильтра во время фильтрации водного раствора был меньше 2 мкм (тип Whatmann 602 h1/2). Чистоту приготовленного C60FAS (т.е. наличие/отсутствие каких-либо остаточных примесей, например сажи, толуольной фазы) определяли методом ВЭЖХ и ГХ/МС анализа. Этим методом была получена максимальная концентрация фуллеренов С60 в воде 0,15 мг/мл.

Состояние фуллеренов C60 в водном растворе контролировали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). При проведении АСМ-анализа образец осаждали на расщепленную слюдяную подложку (марка V-1, поставки SPI) путем осаждения из капли водного раствора. Визуализацию образца проводили в полуконтактном режиме (постукивание) (рис. 1а, б). АСМ-измерения проводили после полного испарения растворителя.

Измерения малоуглового рассеяния нейтронов (SANS) (рис. 1с) проводились на малоугловом дифрактометре YuMO на импульсном реакторе IBR-2 (ОИЯИ, Дубна, Россия) во времяпролетном режиме с установкой из двух детекторов [22]. Обработку исходных данных проводили с помощью программы SAS [23].

Методика и экспериментальные группы
В исследовании использовали крыс-самцов линии Wistar массой 280-350 г. Использование животных было одобрено Комитетом по этике Института и осуществлялось в соответствии с Директивой Совета европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC).

Животные были разделены на 4 группы. В экспериментах усталость m. triceps surae вызывалась электрической стимуляцией n. tibialis. Физиологический раствор (группа 1, n = 6) или C60FAS (F-инъекция) в дозе 0,1–0,15 мг/кг (группа 2, n = 6) вводили в левую ТС после развития утомления. Затем индуцировали утомление правой ТС. Данные, полученные с ипсилатеральной (левой) стороны, считались контрольными значениями по сравнению с данными, полученными с контралатеральной стороны. Диапазон доз 0,1–0,15 мг/кг C60FAS не вызывает какой-либо острой или подострой токсичности у крыс [13]. Крысы 3-й группы (n = 6; животные с усталостью от обоих TS без каких-либо инъекций) и 4-й группы (n = 6; интактные животные) использовались только для биохимических исследований. После эксперимента TS у всех животных во всех группах были изъяты для биохимического анализа.

Важно отметить, что доза 0,1–0,15 мг/кг C60FAS, применяемая в наших экспериментах, не вызывает какой-либо острой или подострой токсичности у животных: она была значительно ниже максимально переносимой дозы фуллерена C60, которая, как было установлено, составляет 5 г/кг как для перорального, так и для внутрибрюшинного введения животным. крысы [13]. Никаких токсических эффектов или летального исхода под действием фуллеренов С60 после их перорального введения крысам в общей дозе 2 г/кг в течение 14 дней зафиксировано не было [24]. Наконец, было показано [13], что водорастворимые фуллерены С60, введенные крысам внутрибрюшинно (0,5 мг/кг), выводились из организма в течение 2-4 дней.

Животным в группах 1 и 2 вводили кетамин (100 мг/кг “Pfizer”, США) в сочетании с ксилазином (10 мг/кг “Interchemie”, Голландия), трахеостомировали и проводили искусственную вентиляцию легких (по необходимости). Левая и правая ТС-мышцы были отделены от окружающей ткани, а их сухожилия отсоединены в дистальных местах введения. Большеберцовая кость была отделена от ткани и перерезана проксимально, и все ветви нерва, кроме тех, которые иннервируют ТС, были перерезаны. Этот нерв был закреплен на биполярном платиновом проволочном электроде для электростимуляции. Мышцы и нервы задних конечностей были покрыты парафиновым маслом в бассейне, образованном из кожных лоскутов. Т-образная мышца была соединена через ахиллово сухожилие с сервоуправляемым мышечным съемником. Мышечное напряжение измерялось с помощью полупроводниковых тензометрических резисторов, приклеенных к жесткой стальной балке, установленной на подвижной части линейного двигателя.

Чтобы вызвать мышечную усталость, использовали 1-3 серии прерывистой высокочастотной электростимуляции продолжительностью 30 мин (рис. 2а), разделенные интервалами отдыха в 10-20 мин. Каждая серия состояла из последовательностей прямоугольных импульсов продолжительностью 0,2 мс со скоростью 40 импульсов в секунду при длительности 12,4 с, разделенных 5-секундными интервалами отдыха (рис. 2b). Ток стимула был установлен на величину, в 1,3–1,4 раза превышающую двигательный порог. Обратите внимание, что если мышечная усталость развивалась менее чем за 30 мин, стимуляция прерывалась (было предсказано, что развитие усталости происходило при снижении мышечной силы более чем на 50% от исходных данных). После окончания стимуляции продолжительностью 12,4 с мышца растягивалась, и изменение длины имело колоколообразную форму (один период синусоидального сигнала частотой 4 Гц с соответствующей фазовой синхронизацией) амплитудой 3,5 мм и длительностью 2 с (рис. 2b; нижний ряд). Мышечная реакция на растяжки проявлялась в виде увеличения напряжения после непрерывной стимуляции. Эти растяжки применялись перед постстимуляционными подергиваниями, чтобы устранить или, по крайней мере, уменьшить последствия, оставшиеся от непрерывной стимуляции [1]. Сигналы (стимулирующие импульсы, мышечное напряжение и другие) отбирались с помощью устройства DAC-ADC (CED Power 1401).

Биохимический эксперимент
Для биохимического анализа вырезанные трицепсы (камбаловидная и икроножная) были быстро препарированы, очищены от жира и сухожилий, разделены на несколько порций и хранились в жидкости N2. Для анализа восстановленного глутатиона (GSH) образцы тканей переносили в среду, содержащую 1 н. хлорную кислоту (1:10 по массе), и гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Potter-Elvehjem с механическим приводом. Полученный гомогенат центрифугировали при 10 000g в течение 10 мин (4°C). Содержание GSH измеряли спектрофотометрически [25]. Для анализа активности ферментов, H2o2 и перекисного окисления липидов образцы мышц размораживали и гомогенизировали в 50 мм фосфатном буфере с 2 мм ЭДТА (рН 7,4) при 4°C (1:9 по массе). Затем гомогенаты центрифугировали в течение 15 мин при 15 000g (4°C), а постмитохондриальный супернатант хранили при температуре -70°C.

Окислительное повреждение в ткани измеряли с помощью анализа веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS). TBAR выделяли путем кипячения гомогенатов тканей в течение 15 мин при 100°C с реагентом тиобарбитуровой кислоты (0,5% 2-тиобарбитуровой кислоты/10% трихлоруксусной кислоты/0,63 М/дм3 соляной кислоты) и измерения поглощения при 532 нм. Результаты выражены в нМ ТБАР/мг белка, используя ɛ = 1,56 × 105 дм3/М1/см1 [26].

Концентрацию H2o2 в гомогенатах тканей измеряли с использованием метода FOX, который основан на опосредованном пероксидом окислении Fe2+ с последующей реакцией Fe3+ с ксиленоловым оранжем (о-крезолсульфонефталеин 3',3"-бис[метилимино] диуксусная кислота, натриевая соль).. Этот метод чрезвычайно чувствителен и используется для измерения низких уровней водорастворимого гидропероксида, присутствующего в водной фазе. Для определения концентрации H2o2 к 500 мкл реагента для анализа (500 мкм сульфата железа аммония, 50 мм H2SO4, 200 мкм ксиленолового апельсина и 200 мм сорбитола) добавляли 500 мкл инкубационной среды. Поглощение комплекса Fe3+-ксиленол оранжевый (A560) было обнаружено через 45 мин. Стандартные кривые H2o2 были получены для каждого независимого эксперимента путем добавления различных количеств H2o2 к 500 мкл основной среды, смешанной с 500 мкл реагента для анализа. Данные были нормализованы и выражены в мкм H2o2 на мг белка [27].

Активность каталазы измеряли по разложению пероксида водорода, определяемому по уменьшению поглощения при 240 нм [28].

GSH определяли с использованием реактива Эллмана. Один миллилитр супернатанта обрабатывали 0,5 мл реактива Эллмана (5,5'-дитио-бис-нитробензойная кислота в абс. этанол) и 0,4 М Трис-HCl буфера с 2 мм ЭДТА, рН 8,9. Поглощение измеряли при 412 нм на спектрофотометре [25].

Концентрацию белка оценивали по методу Брэдфорда с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Все химикаты были приобретены у Sigma, Fluka и Merck и отличались высочайшей чистотой.

Анализ данных
В электрофизиологической части исследования каждая серия стимуляций (30 мин) была разделена на три равные порции (рис. 2а), которые были усреднены (максимум 33 стимуляции в одной порции). Среднее значение первой порции было установлено равным 100%, а остальные серии были нормализованы по отношению к этому (для каждой задней конечности). Максимальные амплитуды спереди (P1) и сзади спереди (P2) (максимальные амплитуды на участке, длительность 1 с, рис. 2b) мышечной силы каждой отдельной серии (12,4 с) были определены и рассчитана разница между P1 и P2 (ΔP). Эта разница определяет динамическую составляющую снижения мышечной силы за короткий период непрерывной стимуляции. Средние значения (mean ± SD) мышечной силы TS до и после F-инъекции сравнивались с использованием двустороннего статистического дисперсионного анализа (ANOVA). Факторы вариации включали два условия, время и эффекты C60FAS. Для определения различий между группами использовался анализ Бонферрони post hoc. Уровень значимости был установлен на уровне p < 0,001.

Биохимические данные выражены в виде средних ± SEM для каждой группы. Различия между экспериментальными группами были выявлены с помощью одностороннего ANOVA с последующим использованием теста множественного сравнения Бонферрони. Значения p < 0,05 считались значимыми.

Результаты
Анализ данных АСМ и SANS
Поскольку размер частиц фуллерена C60 напрямую коррелирует с их биологическим распределением и токсичностью [29, 30], были проведены исследования АСМ и SANS.

На АСМ–изображениях (рис. 1а, б) отчетливо видны беспорядочно расположенные отдельные фуллерены C60 (диаметром 0,7 нм) и их объемные кластеры высотой 1,5-200 нм. В то же время на АСМ-изображении также видны некоторые отдельные агрегаты фуллерена C60 высотой >200 нм (рис. 1b). Полученные результаты согласуются с теоретическими расчетами и экспериментальными измерениями [20, 21, 31, 32] и демонстрируют полидисперсность C60FAS, использованных в нашем исследовании.

Экспериментальная кривая SANS для C60FAS показана на рис. 1с. Кривая рассеяния C60FAS хорошо описывается форм-фактором полидисперсных сферических частиц. Средний радиус вращения поперечного сечения частицы Rg и функция распределения парных расстояний P(r) были найдены с использованием метода косвенного преобразования Фурье (IFT) [33]. Мы можем рассчитать радиус частиц R, присутствующих в C60FAS, в соответствии с хорошо известным уравнением Rg2 = 0.6R2, предполагая однородность и сферичность кластеров фуллерена C60. Этот вывод следует из предыдущих экспериментальных данных [20, 21] и оценок средней плотности скоплений в соответствии с экспериментами по изменению контраста [31, 32, 34]. Данные, полученные с помощью этой процедуры, указывают на то, что C60FAS состоит из сферообразных наночастиц фуллерена C60 со средним размером ~56 нм, что хорошо согласуется с приведенными выше данными АСМ.

Известно [35, 36], что проницаемость и цитохимическое поведение наночастиц сильно зависят от их размера и, соответственно, распределения по массе (количеству). В связи с этим наши предыдущие исследования [16, 18, 19, 29] ясно демонстрируют, что используемые наночастицы фуллерена С60 могут эффективно проникать через плазматическую мембрану клеток путем пассивной диффузии или эндоцитоза (в зависимости от размера) и не проявляют цитотоксических эффектов.

Электрофизиологические эксперименты
Изменения силовой реакции TS в условиях утомления вследствие длительной высокочастотной стимуляции (30 мин, 40/с) большеберцовой кости у животных групп 1 (до и после введения физиологического раствора) и 2 (до применения C60FAS) достоверно не различались. Анализ проводился путем определения уровня силы в начале (P1) и конце (P2) одиночных тетанических сокращений и разницы между этими значениями (ΔP), которая определяет динамическую составляющую уменьшения силы в течение короткого периода непрерывной стимуляции (рис. 2b). Мышца считалась уставшей, если амплитуда одиночных тетанических сокращений уменьшалась более чем на 50% по сравнению с исходным уровнем. При достижении мышечной усталости стимуляцию прекращали и проводили 10-20-минутный период отдыха. Следовательно, в случае с одним животным в результате стимуляции мышечной усталости левой TS уровень усталости в 50% был достигнут приблизительно через 12 мин; в течение следующих 4 мин стимуляции он продолжал снижаться [рис. 3a (IL), b(IL)]. После 10 мин отдыха сила однократного тетанического сокращения была немного восстановлена, но она не достигла исходного уровня мышечной активности и продолжала быстро снижаться [рис. 3a (IIL), b(IIL)]. В этом случае также наблюдалось одновременное уменьшение динамической составляющей падения силы ΔP. Обратите внимание, что динамический компонент был наиболее сильно выражен в начале первой серии экспериментов и что амплитуда P1 была выше по сравнению с амплитудой P2 [рис. 3b (IIL)]. После тетанических сокращений в течение 1,5–2 мин разница между амплитудами P1 и P2 была сведена к нулю с умеренными колебаниями как в одном, так и в противоположном направлении в течение дополнительного периода стимуляции усталости. Одновременно со снижением значений ΔP наблюдалось постоянное уменьшение развиваемой силы. В следующих сериях стимуляции, после периода покоя, начальная амплитуда динамической составляющей обычно уменьшалась [рис. 3b (IIL, IIIL)].

Когда был достигнут заданный уровень мышечной усталости, C60FAS (0,1–0,15 мг/кг) вводили внутримышечно [через 45 мин после начала стимуляции усталости; рис. 3a (IFL, IIFL), b (IFL, IIFL)]. В то же время динамические изменения уровня мышечной силы в ответ на стимуляцию отражали дальнейшее развитие усталости, и силы одиночного сокращения быстро снижались [рис. 3b(IFL)]. Однако F-инъекция привела к постепенному восстановлению уровней изометрической силы (через 32 мин после применения препарата; рис. 3a [(IIFL), b (IIFL)]. Появление отрицательных значений ΔP (увеличение амплитуды P2 по сравнению с амплитудой P1) указывало на начало восстановления [рис. 3b (IIFL), 10-я минута]. В этой серии стимуляций уровень силы мышечного сокращения был восстановлен до того уровня, который развился на начальных стадиях стимуляции усталости.

Силовая реакция правой TS значительно отличалась от реакции левой TS. Примечательно, что TS правой конечности ранее не испытывала усталости перед F-инъекцией (рис. 3c, d). Через 52 мин после введения препарата наблюдалось некоторое снижение силы мышц. В этом случае амплитуда P1 была выше амплитуды P2, на что указывает увеличение значений ΔP [рис. 3c (IFR), d (IFR)]. Однако через 6 мин после начала утомляющей стимуляции сила, развиваемая мышцей, оказалась на определенном стационарном уровне, который удерживался в течение экспериментальной серии. Разница между амплитудами P1 и P2 исчезла (значение ΔP уменьшилось до нуля), что может указывать на постоянный уровень усилия во время нагружения. Важно, что мышца поддерживала уровень развитой силы еще в течение 1 часа [рис. 3c (IIFR, IIIFR), d(IIFR, IIIFR)]. Для этой мышцы общее время снижения изометрической силы сокращения на 50% составило 120 мин после введения препарата. Для сравнения, контрольная продолжительность периода возникновения усталости составила 42 мин.

На рис. 4а, б представлено сравнение изменений уровня усилия, развиваемого левым TS до (IL) и после (IFL) F-инъекции в двух различных экспериментах. Статистический анализ показал значительное (p < 0,001) снижение силы во время серии стимуляций усталости перед введением C60FAS [рис. 4a (IL), b(IL)]. После F-инъекции наблюдалось восстановление мышечной силы у первого животного [рис. 4a (IFL)] и ее удержание у второго животного [рис. 4b (IFL)]. В конце экспериментальной серии восстановление реакции активного мышечного усилия было значительным по сравнению с началом и почти достигло контрольных значений. Анализ показал значительный эффект для факторов: введение лекарственного средства (D) и время (T) после введения и их взаимодействие. Соответствующие результаты этого анализа были следующими: F(D) = 2904,47, p(D) < 0,001, F(T) = 42,420, p(T) < 0,001, F(DxT) = 1350,58, p(DxT) < 0,001 (первое животное) и F(D) = 122,80, p(D) < 0,001, F(T) = 1058,29, p(T) < 0,001, p(DxT) = 1287,35, p(DxT) < 0,001 (второе животное). Данные, полученные во всех экспериментах (рис. 4c–h), указывают на то, что снижение развиваемой силы после введения C60FAS (IFL, IIFR) было почти в два раза медленнее, чем в контроле. Максимально значимое снижение мышечной силы, развиваемой в течение всего периода стимуляции утомления, составило 44% после введения препарата, тогда как в контроле это составило 85%. У всех экспериментальных животных наблюдалась аналогичная динамика снижения уровня силы в контроле и его более постепенное снижение после F-инъекции.

Биохимические эксперименты
Во время длительной стимуляции мышцы метаболические процессы изменяются и являются основным фактором мышечной усталости. В результате теста на усталость было определено накопление вторичных продуктов перекисного окисления липидов и изменения уровней антиоксидантов в ткани утомленной мышцы. Полученные данные наглядно демонстрируют повышенный уровень маркеров перекисного окисления и окислительного стресса TBARS и H2o2 после стимуляции усталостью (рис. 5а, б). Это увеличение было значительным по отношению к интактной мышце (‘норма’) и составило 23% (р < 0,05) для TBARS и 38% (р < 0,05) для H2o2. После введения C60FAS в левую TS концентрация TBARS была значительно снижена по сравнению с усталостью следующим образом: на 29% (р < 0,05) для левой TS и на 12% (р < 0,05) для правой. Уровень H2o2 снижается по сравнению с группой "усталости" (на 6% для левой TS и на 7% для правой), хотя уровень H2o2 оставался выше по сравнению с интактной группой (р < 0,05). В свою очередь, в ответ на такие изменения в работающей мышце происходила активация эндогенных антиоксидантов. Во время стимуляции усталости количество мышечного GSH количественно увеличивалось более чем в два раза (р < 0,05), а активность антипероксидного фермента CAT также увеличивалась. После введения C60FAS активность GSH и CAT была значительно снижена по сравнению с группой "усталость" на 41,8 и 15,4% для GSH и на 53 и 43% для CAT (р < 0,05) для левого и правого TS соответственно (рис. 5c, d).

Обсуждение
В этом исследовании мы исследовали изменения силы сокращения m. triceps surae крысы при развитии усталости до и после введения C60FAS. Мы не использовали уровень стимуляции выше 40 Гц, а период отдыха между сериями экспериментов составлял 15-20 мин [2]. Этот экспериментальный подход позволяет нам проанализировать характер изменения параметров силы мышечного сокращения при стимуляции усталости перед введением C60FAS (в левую ТС) и непосредственно после F-инъекции. Заметное снижение уровня мышечных усилий перед введением C60FAS (контроль) наблюдалось во всех экспериментах как в серии стимуляции IL, так и в серии стимуляции IIL (рис. 4a–h). Это было результатом действия модифицированного паттерна стимуляции, который был обусловлен влиянием центральных и периферических механизмов развития усталости скелетных мышц [2]. После внутримышечного введения C60FAS у двух крыс было зарегистрировано частичное восстановление ипсилатеральной мышцы TS. Однако основной вывод был сделан после применения C60FAS. Незначительное более медленное снижение усилия с последующим длительным удержанием определенного уровня было зарегистрировано контралатерально у всех животных. Снижение силы мышечного сокращения развивалось медленнее после введения C60FAS по сравнению с контролем. Это указывает на замедление процесса утомления, а удержание силы на постоянном уровне в течение длительного времени (120 мин) указывает на увеличение мышечной выносливости в таких условиях. Данные, полученные в этом исследовании, указывают на то, что после введения препарата время снижения максимального уровня TS force до 44% составило 120 минут. В то же время в контрольной группе уровень силы этой мышцы за тот же период снизился до 85%. Мы предполагаем, что это было вызвано антиоксидантным воздействием C60FAS на утомляющуюся мышцу. Продолжительность восстановления мышц и периоды их отдыха также являются важными факторами для поддержания работоспособности и нормального физиологического состояния мышц при выполнении динамической работы [12]. Динамический компонент одиночного тетанического сокращения, вероятно, является отражением взаимодействия эффективности первоначального повышения сократительных свойств быстрой двигательной единицы и процессов снижения усталостной прочности [37]. Таким образом, восстановление мышечной силы после F-инъекции как для предварительно уставших, так и для свежих мышц указывает на то, что водорастворимые первичные фуллерены C60 могут проникать через плазматическую мембрану клеток [18, 19] и оказывать мощное антиоксидантное действие на сократительный аппарат поперечнополосатой мышцы, тем самым способствуя ее функциональному восстановлению после экспериментально вызванной усталости.

При умеренной внешней нагрузке на мышцу метаболизм происходит аэробно. В активно сокращающейся мышце метаболизм значительно усиливается, что приводит к накоплению продуктов вторичного окисления в мышечных волокнах, что приводит к развитию утомления [38]. Эти метаболические процессы являются источником свободных радикалов кислорода и способствуют интенсификации процессов перекисного окисления липидов [39-41]. Наличие таких продуктов метаболизма препятствует адекватному выполнению мышечной работы и увеличивает продолжительность восстановительного периода. Интенсивные физические упражнения и тренировки на выносливость вызывают окислительный стресс в скелетных мышцах и, следовательно, могут изменять прооксидантно-антиоксидантный баланс [42, 43]. Несмотря на обширные многолетние исследования, взаимосвязь между образованием свободных радикалов, антиоксидантных ферментов и физическими нагрузками в скелетных мышцах остается спорной [44, 45]. Эти расхождения могут быть связаны с различиями в режиме упражнений, интенсивности, продолжительности тренировочной программы и типе мышечных волокон. Скелетные мышцы весьма неоднородны. Каждый тип мышечных волокон обладает различными метаболическими характеристиками и окислительным потенциалом, а также способностью к антиоксидантной защите [41]. В нашем исследовании в результате стимуляции усталости в работающей мышце наблюдалось значительное увеличение вторичных продуктов перекисного окисления липидов и H2o2 по сравнению с интактной (нестимулированной мышцей) мышцей (рис. 5). Во время интенсивного сокращения (физической активности) поток кислорода через мышечные клетки значительно увеличивается. Высокие уровни поглощения кислорода (до 100 раз) могут привести к чрезмерной выработке АФК и связаны с усталостью, болезненностью мышц и разрушением миофибрилл [45]. Более того, другим потенциальным механизмом, участвующим в реакции окислительного стресса на высокоинтенсивные физические нагрузки, является перераспределение кровотока, такое как повышенный кровоток в сердце, легких и красных медленно сокращающихся мышечных волокнах, что приводит к усилению митохондриального дыхания, что приводит к увеличению выработки АФК. Мы обнаружили, что длительная электрическая стимуляция мышц индуцировала значительное увеличение содержания TBARS и H2o2, что приводило к увеличению активности CAT и содержания GSH как в быстро-, так и в медленно сокращающихся мышечных волокнах. В этом случае после введения C60FAS концентрация кислородного метаболита была значительно ниже. Это подтверждает предыдущие данные о защитном действии C60FAS на иммунную и антиоксидантную системы организма при различных патологиях [15, 46]. Механизмы действия этого препарата могут положительно влиять на процессы выносливости и восстановления активных мышц, инактивируя продукты их метаболизма.

Повышенное количество GSH в стимулированной мышце (без введения препарата и после его применения) свидетельствует о компенсаторной активации эндогенных антиоксидантных систем при раздражающем воздействии достаточной силы (рис. 5). Многие исследования показали, что во время интенсивного стресса наблюдается значительное снижение восстановленного GSH и повышенная концентрация его окислительной формы в миокарде и камбаловидной мышце [47, 48]. Одновременно в экспериментах по изучению выносливости были получены противоречивые данные [47, 49]. Было обнаружено, что при физической нагрузке количество сниженного GSH в икроножной мышце и DVL увеличиваются. Вероятно, что в m. soleus, мышце с высоким содержанием миоглобина, все метаболические и биохимические процессы протекают в аэробных условиях, в которых используется большое количество митохондриальных ферментов, и накопление окисленного GSSG не успевает уменьшаться [50]. В то же время вышеупомянутые процессы в m. gastrocnemius протекают анаэробно, в отличие от m. soleus. Это вызывает медленный процесс окисления и увеличивает количество восстановленного GSH [51, 52]. При переутомлении, после введения C60FAS, содержание GSH было несколько снижено по сравнению с состоянием “усталости”, что указывает на снижение окислительного стресса и нормализацию про- и антиоксидантного баланса в мышечной ткани крыс (рис. 5).

Увеличение H2o2 во время физической нагрузки приводит к увеличению активности фермента CAT, который выполняет защитную антиоксидантную функцию, катализируя разложение перекиси водорода до воды и кислорода. Эти результаты подтверждаются ранее полученными данными из острых экспериментов на крысах со стимуляцией DVL [47, 52]. Повышение активности фермента в ответ на физическую нагрузку было также показано у людей [53]. Более того, некоторые исследования указывают на отсутствие каких-либо изменений концентрации CAT в мышцах во время физической активности [44, 54, 55]. Фактически, в нескольких отчетах продемонстрировано снижение активности каталазы как в окислительных, так и в смешанных волокнах мышц конечностей [56, 57]. В нашем исследовании после введения C60FAS при развитии усталости активность CAT была значительно снижена по сравнению с чистой усталостью и оставалась на контрольном уровне. Предполагается, что C60FAS влияют на содержание и активность эндогенных антиоксидантов и предотвращают возникновение усталости в активно сокращающейся мышце, тем самым способствуя поддержанию ее нормального физиологического состояния.

Усиление свободнорадикальных процессов является основным патогенетическим фактором при развитии утомления скелетных мышц [58]. При значительной физической нагрузке в мышечной ткани происходит сильное перепроизводство свободных радикалов, что усиливает процессы перекисного окисления липидов, повреждения клеточных мембран и инактивацию антиоксидантных ферментов [59]. Активные метаболиты кислорода вызывают прямое ингибирование митохондриальных ферментов дыхательной цепи и снижение баланса АТФ/АДФ [59]. Вышеуказанные процессы на фоне накопления лактата с последующим развитием ацидоза и блокады мембранных Са2+ каналов приводят к выраженному энергетическому дефициту и значительному снижению функциональной активности мышечной ткани [60].

Известно, что применение экзогенных антиоксидантов различной природы приводит к значительному снижению утомляемости скелетных мышц при интенсивной физической нагрузке и увеличивает время наступления мышечной усталости при длительных интенсивных упражнениях на выносливость [10, 61, 62]. Эти данные демонстрируют целесообразность использования антиоксидантов для коррекции уровня окислительного стресса в мышечной ткани при экстремальных воздействиях на организм и повышения его эффективности. Поскольку первозданные фуллерены С60, как ранее было показано на различных моделях in vitro и in vivo [13, 15, 63], активно связывают свободные радикалы и проявляют мощные антиоксидантные свойства прямого действия, мы можем предположить, что применение водорастворимых фуллеренов С60 привело к нормализации прооксидантно-антиоксидантного баланса в организме. мышечной ткани крыс и способствовал улучшению динамических параметров мышечного сокращения.

Вывод
Применение C60FAS даже в низкой терапевтической дозе (0,1–0,15 мг/кг) приводит, с одной стороны, к сокращению времени восстановления силы мышечного сокращения (после состояния полного истощения) и увеличению времени активной работы мышц (выносливости) до утомления развитие, с другой стороны. Этот результат иллюстрирует влияние C60FAS, наряду с другими возможными механизмами, на прооксидантно-антиоксидантный гомеостаз в мышечной ткани крыс.