Абстрактный
Бесчисленные исследования показали, что [60] фуллерен (С60) и его производные могут иметь множество потенциальных биомедицинских применений. Однако, хотя несколько независимых исследовательских групп показали, что С60 не обладает острой или подострой токсичностью на различных экспериментальных моделях, спустя более 25 лет после его открытия судьба этого фуллерена in vivo и хронические эффекты остаются неизвестными. Если необходимо реализовать потенциал С60 и его производных в области биомедицины, необходимо решить эти проблемы. Здесь мы показываем, что пероральное введение С60, растворенного в оливковом масле (0,8 мг/мл), в повторных дозах (1,7 мг/кг массы тела) крысам не только не влечет за собой хронической токсичности, но и почти удваивает продолжительность их жизни. Эффекты растворов C60-оливкового масла в экспериментальной модели интоксикации CCl4 у крыс убедительно свидетельствуют о том, что влияние на продолжительность жизни в основном обусловлено ослаблением возрастного усиления окислительного стресса. Фармакокинетические исследования показывают, что растворенный С60 всасывается в желудочно-кишечном тракте и выводится через несколько десятков часов. Эти важные результаты в области медицины и токсикологии должны открыть путь для многих возможных - и ожидаемых - биомедицинских применений С60, включая терапию рака, нейродегенеративных расстройств и старения.

Вступление
С 1993 года бесчисленные исследования показали, что [60] фуллерен (С60) и его производные обладают огромным потенциалом в нескольких областях биологии и медицины [1], главным образом, включая специфическое расщепление ДНК, визуализацию [2], УФ- и радиозащиту [3], противовирусную, антиоксидантную и антиамилоидную активность [1], [4], [5], [6], [7], ингибирование аллергической реакции [8] и ангиогенеза [9], иммуностимулирующие и противоопухолевые эффекты [10], [11], усиливающее влияние на рост нейритов [12], доставку генов [13] и даже рост волос деятельность [14]. Однако, хотя несколько независимых исследовательских групп подтвердили безвредность первозданного С60 [15], [16], [17] токсичность этого фуллерена все еще остается предметом дискуссий [18], [19]. Как недавно было продемонстрировано, это в основном связано с отсутствием характеристик тестируемых материалов [15], [16], [17], [18], [19]. Тем не менее, метаболическая судьба и хронические эффекты самого С60 in vivo все еще остаются неизвестными. Для того чтобы реализовать потенциал С60 и его производных в области биомедицины, необходимо решить эти проблемы.

Водные суспензии ранее использовались для исследования острой и подострой токсичности, а также антиоксидантных свойств нетронутого C60 in vivo [20], [21]. Но такие суспензии не подходят для определения токсичности при повторных дозах, поскольку фуллерен активен только в растворимой форме [21] и поскольку чрезвычайно медленное растворение С60 в биологических средах не позволяет точно контролировать активную фракцию [21]. Это может быть причиной того, что, насколько нам известно, хроническая токсичность С60 никогда не исследовалась.

С60 растворим в липидных каплях внутри живых клеток [21], а также в жирах в целом [22], [23]. Более того, C60 может свободно пересекать мембранные барьеры, что было обнаружено экспериментально [21] и недавно смоделировано с помощью компьютерного моделирования [24]. Таким образом, взаимодействие C60 с живыми системами, а также его токсичность следует определять с использованием растворимых форм.

Недавно липосомы были использованы в качестве носителей для изучения биораспределения немодифицированного С60 у крыс после введения в хвостовую вену [25]. Но, поскольку С60 не был обнаружен в крови из-за его быстрого выведения путем тканевой фильтрации, такая формулировка не подходила для характеристики его фармакокинетики [25].

Хотя растворимость С60 в растительных маслах [22], [23] недостаточно высока для изучения его острой токсичности в соответствии с институциональными рекомендациями (Европейское агентство по лекарственным средствам, Оценка лекарственных средств для использования человеком, 2004) [26], такие растворы должны быть вполне подходящими для изучения его хронической токсичности при повторных дозах [27].

Поскольку поведение растворимых форм С60 in vivo, включая всасывание, биораспределение и элиминацию, было неизвестно, мы определили судьбу С60, растворенного в оливковом масле, in vivo, прежде чем изучать его хронические эффекты при повторных дозировках.

Масляные растворы нельзя вводить внутривенно из-за возможной обструкции сосудов, поэтому мы охарактеризовали фармакокинетику C60, растворенного в оливковом масле (0,8 мг/мл), после перорального введения (o.g.) и внутрибрюшинного (i.p.) введения крысам (4 мг/кг массы тела (мг/кг массы тела)).

Наконец, поскольку известно, что С60 является мощным антиоксидантом [5], [6], [21], мы проверили влияние растворов С60 и оливкового масла на окислительный стресс в классической модели интоксикации CCl4 у крыс [28], [29]. Хотя окислительный стресс, связанный с интоксикацией CCl4, маловероятен при физиопатологических состояниях, интоксикация CCl4 у крыс обеспечивает важную модель для выяснения механизма действия гепатотоксических эффектов, таких как жировая дегенерация (стеатоз), фиброз, гепатоцеллюлярная гибель и канцерогенность, связанная с окислительным стрессом [28], [29].

Фрагменты разделов
С60-приготовление раствора для оливкового масла
Оливковое масло первого отжима получают из тунисского сорта Чемлали Буграра, выращенного в районе Сахеля. С60 (чистота 99,98%) был получен от SES Research Corporation (США) и использовался без дополнительной очистки.

Пятьдесят мг С60 растворяли в 10 мл оливкового масла путем перемешивания в течение 2 недель при комнатной температуре в темноте. Полученную смесь центрифугировали при 5000 g в течение 1 ч, а надосадочную жидкость фильтровали через миллипоровый фильтр с пористостью 0,25 мкм.

Исследования фармакокинетики и биораспределения
Все экспериментальные процедуры были

C60-приготовление оливкового масла
Состав и качественные характеристики оливкового масла были определены, как описано ранее, с использованием аналитических методов, описанных в Правилах Европейского союза EEC 2568/91 и EEC 1429/92 [35].

Полученный раствор С60-оливкового масла имеет фиолетовый цвет и содержит 0,80 ± 0,02 мг/мл (n = 6), как определено методом ВЭЖХ [30] после соответствующего разведения в подвижной фазе. Хроматографический профиль и выделенные спектры этих растворов аналогичны таковым, полученным при приготовлении контрольного раствора С60-толуола

С60-оливкового масла
Хорошо известно, что С60 и его производные склонны к агрегации даже в самых лучших растворителях [37]. Раствор С60-оливкового масла, использованный в данном исследовании, можно считать свободным от агрегатов С60, поскольку: 1 – его цвет фиолетовый, что характерно для растворов С60, в то время как цвет растворов, содержащих агрегаты С60, скорее коричневый, что верно даже для водорастворимых производных [3]; 2 – он легко и мгновенно растворяется в толуоле, в отличие от растворов, содержащих заполнитель С60,

Вывод
Влияние первозданного С60 на продолжительность жизни подчеркивает отсутствие хронической токсичности. Эти результаты, полученные на небольшой выборке животных с исследовательским протоколом, требуют проведения более обширных исследований для оптимизации всасывания С60 в кишечнике, а также различных параметров протокола введения: дозы, дозировки и продолжительности лечения. В данном случае лечение было прекращено, когда контрольная крыса умерла на M17, что доказывает, что эффекты лечения C60 являются длительными

Признание
Эта работа была частично поддержана грантом CMCU (ссылка №: ST/AM/GM/4C5 001/n° 1233. Цитата: 6.2.2).