Абстрактный

Водорастворимая форма фуллерена С60 является многообещающим средством для контроля АФК-зависимого воспаления, включая аллергические заболевания. Противовоспалительные эффекты водной дисперсии C60 (nC60) оценивали на мышиных моделях атопического дерматита с использованием подкожных (SC) и надкожных (EC) аппликаций в течение 50 дней. Высокостабильный nC60 был получен путем исчерпывающего диализа водно-органического раствора C60 с водой, где размер и ζ-потенциал наночастиц фуллерена составляют около 100 нм и -30 мВ соответственно.

Результаты
Чтобы вызвать воспаление кожи, самок мышей BALB/c сенсибилизировали овальбумином три раза в течение одной недели. Раствор nC60 вводили мышам подкожно (SC) (0,1 мг/кг) и эпикутанно (EC) (1 мг/кг). Значительное подавление продукции IgE и Th2 цитокинов и сопутствующее повышение концентрации Th1 цитокинов наблюдалось в группах, получавших nC60. Кроме того, при применении EC наблюдалось значительное повышение уровней экспрессии мРНК Foxp3+ и филаггрина. Гистологическое исследование образцов кожи показало, что терапевтический эффект был достигнут как при лечении ЭК, так и при СК, но при ЭК он был более эффективным. Наблюдалось выраженное уменьшение эозинофильной и лейкоцитарной инфильтрации в обработанных образцах кожи.

Выводы
Мы предполагаем, что лечение nC60 смещает иммунный ответ с Th2 на Th1 и в некоторой степени восстанавливает функцию кожного барьера. Этот подход может стать хорошей альтернативой лечению аллергических и других воспалительных заболеваний.

Ключевые слова: Фуллерен С60, атопический дерматит, мышиная модель, цитокин
Идти к:
Фон
Атопический дерматит (AD) - хроническое воспалительное заболевание кожи, которое поражает преимущественно детей и характеризуется поражениями кожи, стойкой эритемой, шелушением, экскориациями и зудом. Кроме того, это заболевание обычно ассоциируется с аллергическим ринитом и астмой. За последние 30 лет во всем мире число пациентов с БА увеличилось на 10-30% у детей и на 2-10 % у взрослых [1-3]. БА является результатом сложного взаимодействия нескольких генетических факторов, нарушений барьерной функции кожи, воздействия различных аллергенов и инфекционных агентов, а также особенностей иммунного ответа [4-6]. У 60 % пациентов БА начинается в возрасте до 6 лет, у 18 % - после 20 лет [7]. Его патогенез связан с нарушениями кожного барьера, что приводит к аномально усиленной кожной презентации антигенов/аллергенов иммунной системе [8, 9]. У многих пациентов с БА ведущую роль играют Th2/IgE-опосредованные аллергические реакции, однако на начальной стадии поражения преобладают Th2-клетки с переключением на Th1-клетки в хронической фазе. Как правило, заболевания, возникающие в результате дисфункции иммунных клеток и/или их продуктов, часто проявляются кожными симптомами [10]. Многие наблюдения свидетельствуют о том, что аллергические и воспалительные заболевания кожи, такие как БА, опосредуются окислительным стрессом [11-13]. Тучные клетки генерируют в основном внутриклеточные активные формы кислорода (АФК) после агрегации FceRI; эти АФК могут выступать в качестве вторичных мессенджеров при индукции нескольких биологических реакций [14]. Выработка АФК индуцирует окислительное повреждение белков в роговичном слое, что приводит к нарушению барьерной функции и обострению БА [15, 16].

Фуллерен представляет собой форму молекулярного углерода со сфероидной структурой и обладает сильной антиоксидантной активностью. В настоящее время фуллерен С60 производится промышленным способом в больших количествах и доступен в продаже. Его уникальные свойства включают сильную электроноакцепторную активность, высокую поляризуемость и гидрофобность; большая поверхность молекулы С60 позволяет присоединять различные гидрофильные добавки, открывая перспективы для разработки новых биомедицинских продуктов. Фуллерен и некоторые его производные, являясь мощными антиоксидантами (in vitro и in vivo), способны эффективно инактивировать АФК [17]. Важной особенностью фуллерена С60 является его низкая токсичность [18, 19], проницаемость через биологические мембраны [20, 21] и отсутствие иммуногенности [22]. Таким образом, фуллерен представляет собой многообещающее терапевтическое средство для лечения аллергии и других воспалительных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера и БА.

Противовоспалительная активность производных фуллерена была зафиксирована несколькими исследователями, и, в частности, исследователи из группы Luna (возглавляемой доктором К. Л. Кепли) были пионерами в этой области [23-26]. Некоторые соединения, содержащие С60, были способны ингибировать IgE-зависимую аллергическую реакцию. Например, фуллеренол (C60(OH)n) и аминофуллерен (C60(NHCH2CH3)n) ингибировали in vitro IgE-зависимую дегрануляцию тучных клеток и секрецию цитокинов и простагландинов в ответ на аллерген, и авторы предположили, что этот эффект связан с более низкими уровнями АФК в стимулированных клетках [23]. С другой стороны, водная дисперсия С60, полученная по методу Андриевского [27], индуцировала экспрессию генов провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-α, IL-6) и цитокинов Th1 (IL-12, IFN-γ) у мышей путем введения аэрозоля в дыхательные пути [28]. Водная дисперсия C60 (nC60) оказывала ингибирующее действие на IgE-опосредованное высвобождение гистамина из базофилов периферической крови in vitro и подавляла анафилаксию у мышей, вызванную введением овальбумина [29]. Аналогичная дисперсия C60 проявляла значительную модулирующую активность в реакции DTH, подавляя высвобождение цитокинов Th1 [30, 31].

Фуллерен С60 в водных средах всегда существует в виде наночастиц (кластеров), и, следовательно, степень их возможного нежелательного эффекта все еще обсуждается [32, 33]. В нескольких исследованиях наночастицы воспринимаются как токсичные агенты, в других — повреждение не обнаруживается. Как было показано, наночастицы полистирола усугубляли AD-подобные поражения кожи [34], а наночастицы оксида металла, такие как ZnO, индуцировали системную выработку IgE-антител [35]. В настоящее время наночастицы используются для чрескожной доставки лекарственных препаратов, но не для терапии БА [36, 37]. Следует отметить, что использование фуллерена при БА описано не было.

Целью данного исследования была оценка терапевтических свойств nC60, полученных новым биосовместимым методом для лечения БА, индуцированного на мышиной модели [38].


Результаты
Водный раствор фуллерена, nC60
Недавно мы предложили новый простой метод приготовления водного раствора С60 с использованием “принципа диализа” [39]. Вкратце, схема протокола включает растворение кристаллического фуллерена в N-метилпирролидоне (NMP), разбавление этого раствора дистиллированной водой или водным раствором l-аминокислоты, используемой в качестве стабилизирующего агента, с последующим полным диализом против деионизированной воды. Таким образом, протокол исключает использование токсичных органических растворителей (толуол, тетрагидрофуран), а также обработку ультразвуком, нагрев и длительное перемешивание, часто используемые в известных методах [27, 40, 41]. Такой подход обеспечивает высокую скорость перевода фуллерена С60 из кристаллического состояния в раствор с концентрацией С60 до 1 г/л (при дополнительной концентрации в вакууме) и гидродинамический размер частиц С60 около 80-100 нм (таблица 1). Спектр поглощения nC60 характеризуется тремя интенсивными максимумами при 219, 265 и 344 нм и слабой широкой полосой между 400 и 500 нм, и он практически не отличался от таковых у nC60, полученных другими методами. ИК−спектры высушенного nC60 показывают полосы колебаний свободных молекул C60 при 1182 и 1428 см−1 и дополнительные полосы при 3500-3200, 1650-1660 и 1000-1100 см-1 из-за очевидного присутствия остаточных молекул воды и NMP (в качестве донорно–акцепторного комплекса). Расчеты молярного отношения NMP к фуллерену показали значение 0,7–1,1, в то время как расчет отношения H2O к C60 на основе содержания водорода дал значения от 5 до 10. Известно, что NMP обладает низкой токсичностью при пероральном, кожном и ингаляционном способах доставки. В медицине он давно используется в качестве компонента медицинских устройств, одобренных Европейской комиссией и FDA, и, таким образом, может считаться безопасным [42]. Кроме того, хорошая термостойкость позволяет стерилизовать раствор С60 перед его введением в организм. В этом исследовании концентрация C60 в исходном nC60 составляла 120 мкг/мл.

nC60 модулирует выработку аллергенспецифических антител
Чтобы вызвать у мышей AD [38, 43, 44], самок мышей BALB/c сенсибилизировали к EC путем нанесения на кожу доз 100 мкг яйцеклеток в PBS (1 мг/мл) в течение трех однонедельных воздействий с двухнедельными интервалами, как описано в “Материалах и методах” и показано в Рис. 1 (группа “Реклама”). Мыши получали nC60 как EC (“nC60 EC”), так и SC (“nC60 SC”) путями введения в дозах 1 мг/кг и 0,1 мг/кг nC60, соответственно, между введениями яйцеклеток. Контрольная группа получала только применение PBS (“плацебо”). На рисунке 2 показано, что уровни IgE и IgG1, специфичных для яйцеклеток, в сыворотках крови были повышены у мышей, сенсибилизированных к яйцеклеткам (группа “AD”). Главный вопрос заключался в том, может ли лечение nC60 изменить уровень специфичных к яйцеклеткам антител у мышей, сенсибилизированных к яйцеклеткам.

Для оценки влияния обработки nC60 на выработку специфических IgE и IgG были собраны сыворотки после 2-й и 3-й сенсибилизации. Как видно из рис. 2а, специфические концентрации IgE у мышей, сенсибилизированных к яйцеклеткам, были снижены после обработки nC60. Введение nC60 SC оказывало более сильное ингибирующее действие на выработку IgE по сравнению с введением EC. Эта тенденция наблюдалась как после 2-й, так и после 3-й OVA-сенсибилизации (2 и 3 сенсибилизации, рис. 2). После последней сенсибилизации снижение концентрации IgE составило около 50% (статистически значимо). Для каждой группы были измерены уровни специфичных для яйцеклеток IgG1 и IgG2a и соотношение IgG1/IgG2a в качестве маркеров ответов Th2 и Th1 [45], и результаты (рис. 2b) свидетельствуют о том, что лечение nC60 не оказало статистически значимого влияния на выработку специфических антител (хотя тенденция к снижению, особенно после 3-наблюдалась сенсибилизация к рд).

Индуцированные фуллеренами изменения цитокинового профиля
Анализ экспрессии цитокинов проводили после 3-й сенсибилизации в супернатантах стимулированных яйцеклетками спленоцитов мыши (3 сенсибилизации, рис. 1). Было показано, что nC60 оказывает сильное действие, поскольку концентрация IL-4 была снижена в 2,5 раза по сравнению с группой “AD” независимо от способа введения (рис. 3а). Тот же эффект мы также наблюдали для IL-5. В этом случае при применении EC наблюдался несколько более сильный эффект (рис. 3b).

На рисунке 3с показано, что концентрация IL-12 была значительно выше в группах “nC60 EC” и “плацебо” по сравнению с группами “AD” и “nC60 SC”. Экспрессия IFN-γ была значительно повышена в группе nC60 по сравнению с “AD” и нормальным контролем (“плацебо”) Рис. 3d. Более того, самый сильный эффект наблюдался после лечения EC/nC60.

Индукция Foxp3 + регуляторных клеток (Foxp3 + Tregs)
В этом исследовании мы измерили экспрессию Foxp3 в стимулированных яйцеклетками спленоцитах мыши, чтобы оценить уровень Foxp3 + Tregs после лечения nC60. Как мы можем видеть, значительное увеличение экспрессии Foxp3 наблюдалось в группе “nC60 EC” по сравнению с “AD” и “плацебо” (рис. 4). Уровень Foxp3 был лишь немного выше в группе “nC60 SC”, чем в “AD”.

Анализ экспрессии филаггрина
Мы использовали количественную ПЦР в реальном времени для оценки влияния nC60 на экспрессию FLG у мышей, индуцированных AD (рис. 5). Было показано, что nC60 эффективно стимулирует экспрессию FLG. Наиболее значительное увеличение FLG наблюдалось при применении EC/nC60, в этом случае экспрессия FLG была увеличена примерно в 3 раза (р < 0,05).

Гистологический анализ
Биопсии кожи сенсибилизированных мышей были взяты после заключительной 3-й сенсибилизации. Срезы кожи окрашивали H&E и исследовали при 100-кратном увеличении. Образцы кожи из группы “AD” имели некроз дермы и эпидермиса от тяжелой до средней степени. Были видны выраженная гиперплазия эпидермиса, выраженные диффузные смешанные лейкоцитарные инфильтраты с преобладанием эозинофилов как в дерме, так и в эпидермисе (рис. 6а). Клеточный инфильтрат состоял из нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов, в то время как в группе “плацебо” не наблюдалось никаких патологических изменений, демонстрирующих почти нормальный внешний вид (рис. 6d). Степень инфильтрации лейкоцитов в дерме и эпидермисе была снижена у мышей, получавших SC/nC60 (“nC60 SC”), по сравнению с “AD”, однако количество эозинофилов было таким же, как и у “AD” (рис. 6с). В этом случае мы наблюдали уменьшение некроза эпидермиса и деструктивного кровоизлияния в дерму. Наблюдался умеренный эпидермальный гиперкератоз, очевидно, как компенсаторный механизм защиты от повреждений. На рисунке 6b показано, что наиболее выраженный терапевтический эффект nC60 наблюдался у мышей, получавших EC nC60 (“nC60 EC”). Степень инфильтрации лейкоцитами и количество эозинофилов были значительно снижены в группе “nC60 EC” по сравнению с “AD” и “nC60 SC”. Было показано, что эпидермальный некроз, деструктивные кровоизлияния в дерму и гиперкератоз либо отсутствовали, либо были умеренными.

Мы оценивали гистологические снимки по полуколичественному гистологическому индексу (score), сравнивая группы, получавшие и не получавшие nC60, друг с другом на основе микроскопических признаков. Утолщение эпидермиса, эпидермальный некроз, эпидермальный гиперкератоз, некроз дермы и подкожно-жировой клетчатки, отек, кровоизлияние и клеточная инфильтрация дермы и подкожно-жировой клетчатки были основными критериями оценки гистологических поражений кожи (таблица 2). Каждый параметр имел степень выраженности, оценочное условное значение и соответствующий балл.

На рисунке 6e показано, что максимальный воспалительный индекс наблюдался в группе “AD” (оценка = 24), в то время как в группе “плацебо” показано значение 4. Воспалительные индексы для групп “nC60 EC” и “nC60 SC” составили 14 и 18 соответственно. Таким образом, гистологический анализ образцов кожи показал, что терапия nC60 улучшила гистологическую картину, уменьшив аллергическое воспаление приблизительно на 42 и 25% соответственно при применении EC и SC по сравнению с необработанными мышами.

Идти к:
Обсуждение
Исследование биологических эффектов фуллерена С60 в последние годы привлекает все большее внимание. Важной проблемой является то, что кристаллический фуллерен С60 практически нерастворим в водной среде без специальной обработки. В этом исследовании водный раствор фуллерена был приготовлен новым методом диализа [46]. Основываясь на спектральном и элементном анализах, мы можем предположить, что процесс, лежащий в основе солюбилизации C60, может включать образование комплексов молекул C60 или их кластеров с NMP с последующим частичным гидроксилированием поверхности наночастиц, которое способно стабилизировать агрегаты nC60. По-видимому, эти агрегаты окружены прочно связанной водной оболочкой; вода не удаляется при сушке под высоким вакуумом. Мы предполагаем, что связь между C60 и NMP определенно носит нековалентный характер (донорно-акцепторная связь), о чем свидетельствуют экспериментальные результаты и теоретические расчеты [47]. Следует отметить, что с течением времени (>6 месяцев) мы наблюдали уменьшение неоднородности размеров наночастиц, они стали более однородными по размеру (100 нм). Возможно, это отражает установление динамического равновесия в системе, в которой происходит процесс распределения молекул фуллерена от кластера к кластеру.

Мы предполагаем, что новый способ получения nC60 в качестве биосовместимого процесса потенциально очень подходит для медицинского применения. Взаимосвязь между основными физико-химическими характеристиками и токсическими эффектами (in vivo) nC60 практически не освещалась в научной литературе. Недавно была описана взаимосвязь между дзета-потенциалами и размером функционализированных агрегатов С60 и их влиянием на токсичность в отношении бактериальных клеток. Было показано, что увеличение поверхностного заряда (безразлично, + или −) всегда приводит к уменьшению размера наночастиц, но токсичность всегда связана с положительно заряженными агрегатами C60 [48]. Наночастицы в nC60 всегда несут отрицательный заряд. В других исследованиях было показано, что размерные эффекты влияют на цитотоксичность nC60. Авторы предполагают, что этот эффект может быть связан с поверхностью наночастиц, контактирующей с клетками. Размер наночастиц отрицательно коррелирует с их токсичностью [49]. Вопрос о токсичности водорастворимой формы С60 тесно связан с морфологией наночастиц и химическим составом их поверхности, который также определяется способом их получения. Поверхность частиц nC60 отличается от описанных в литературе ввиду присутствия сложного гидрофильного компонента, NMP, и частичного гидроксилирования [46]. Наши исследования безопасности nC60 при остром внутривенном введении мышам BALB/c показали, что летальных исходов не наблюдалось, а масса тела увеличивалась по схеме, аналогичной контрольной группе (неопубликованные наблюдения). Точная доза для людей будет определена только на этапе клинических испытаний.

Некоторые исследователи обнаружили, что производные фуллерена, такие как фуллеренол и аминофуллерен, ингибируют in vitro IgE-зависимую дегрануляцию тучных клеток, секрецию Th2-цитокинов и простагландинов в ответ на стимуляцию аллергеном, которая, по-видимому, частично происходит за счет ингибирования клеточных уровней АФК [23]. Определенные производные фуллерена были способны предотвращать развитие воспаления и отека у мышей после введения форбол-миристат-ацетата (PMA) [24]. Было показано, что ингибирование зависит от структуры добавок, прикрепленных к углеродному скелету. Например, фуллерен С70, содержащий 4 молекулы гликолевой кислоты, заметно ингибировал искусственно вызванную анафилаксию, и в то же время фуллерен с 4 присоединенными молекулами инозитола не проявлял никакой активности. Было показано, что фуллереновый материал при контакте с сывороточной средой или в клетках способен связываться с альбумином и другими белками, включая некоторые ферменты. Таким образом, возможно, он модулирует как ферментативные, так и сигнальные окислительно-восстановительные процессы в клетке, но имеющиеся данные очень ограничены [25].

Ранее, на основе мышиной модели DTH, было показано, что обработка фуллеренами значительно ослабляла воспаление подушечки стопы по сравнению с контролем DTH и переключала баланс цитокинов в сторону доминирования Th1 [50]. Позже мы также показали, что выработка цитокинов Th1 была значительно подавлена, однако интригующим было то, что цитокины Th2 IL-4 и IL-5 также были значительно подавлены обработкой фуллеренами [31].

Эти исследования были предприняты для того, чтобы оценить индуцированную яйцеклетками секрецию Th1 и Th2 цитокинов и определить, может ли лечение nC60 изменить ответ Th2 на Th1 и модулировать выработку провоспалительных цитокинов. Th2-клетки продуцируют IL-4 и IL-5, которые играют важную роль в гиперчувствительности немедленного типа и, по-видимому, участвуют в начальных стадиях БА.

Также был исследован уровень цитокинов Th1, включая IL-12 и IFN-γ. IL-12, ключевой фактор дифференцировки Т-клеток в Th1-клетки, играет доминирующую роль при многих воспалительных заболеваниях, таких как БА, и стимулирует выработку IFN-γ [51]. Таким образом, мы продемонстрировали, что терапевтическое лечение мышей с AD nC60 сдвигает иммунный ответ с Th2 на Th1, например, изменяя соотношение IgG1/IgG2a в качестве маркеров для ответов Th2 и Th1. Мы не знаем точного механизма, но можно предположить, что это явление связано с действием nC60 на окислительно-восстановительный гомеостаз. АФК и другие редокс-активные молекулы выполняют ключевые функции в иммунитете и сдвиге Th1/Th2, который, по-видимому, в решающей степени зависит от активации редокс-чувствительных сигнальных каскадов [52].

Иммунная регуляция и толерантность являются важными функциями иммунной системы для предотвращения и ограничения вредных иммунных реакций на собственные и несамостоятельные антигены. Регуляторные Т-клетки CD4/CD25 (Tregs) [53] представляют собой уникальную линию иммунорегуляторных клеток как у человека, так и у животных и играют центральную роль в поддержании иммунологической самотолерантности и участвуют в высвобождении противовоспалительного цитокина IL-10 [54]. Недостаток Foxp3 + CD4+CD25+ Т-клеток приводит к нарушению иммунной регуляции, и у пострадавших пациентов часто наблюдаются кожные поражения, подобные AD, повышенный уровень IgE и усиленные реакции Th2. Однако сообщалось о противоречивых результатах относительно количества и функций Tregs при БА. Некоторые исследователи [55] продемонстрировали отсутствие Foxp3 + Tregs в коже пациента, что указывает на дисрегуляцию в процессе воспаления. Напротив, другие авторы [56] показали повышенное количество циркулирующих CD4+CD25+ Tregs с нормальной супрессивной функцией у пациентов с БА. Однако они использовали только экспрессию молекулы CD25 (без Foxp3) в качестве маркера Tregs.

Этот эксперимент ясно показывает, что обработка EC фуллереном приводит к повышенной экспрессии Foxp3 и может пролить свет на механизм терапевтического эффекта nC60.

Ослабление барьерной функции кожи у пациентов с мутациями в гене филаггрина (FLG), вероятно, способствует повышенному проникновению аллергенов трансдермальным путем. Существует прямая взаимосвязь между AD и нонсенс-мутациями в гене, кодирующем филаггрин [3]. Следовательно, одной из возможных терапевтических стратегий регулирования AD является усиление экспрессии FLG [57]. Недавно Otsuka et al. провели скрининг более 1000 соединений в библиотеке биологически активных химических веществ, чтобы найти кандидатов для стимуляции экспрессии мРНК FLG, и выявили, что соединение JTC801 способствует экспрессии мРНК FLG и белка in vitro и in vivo. На потенциальную полезность такой терапии указывает тот факт, что незначительное увеличение числа копий филаггрина на 20% приводит к снижению восприимчивости к БА на 40% [25, 58].

Основываясь на гистологических данных и изменении профиля секреции цитокинов с Th2 на Th1, мы можем заключить, что фуллерен nC60 обладает значительной противоаллергической и противовоспалительной активностью. Мы наблюдали значительное подавление продукции IgE и Th2 цитокинов (IL-4 и IL-5) и сопутствующее увеличение продукции Th1 цитокинов: IL-12 (только при применении EC) и IFN-γ. Однако наблюдалась разница в эффекте nC60, зависящая от способа введения. При применении EC наблюдалось более интенсивное подавление специфических IgE и Th2 цитокинов. Кроме того, это лечение значительно повышало уровень IL-12 по сравнению с “AD”. Основываясь на этих фактах, мы можем предположить, что nC60 уменьшает воспаление при AD путем активации продукции IFN-γ и подавления ответа Th2 [58]. Эти результаты позволяют предположить, что nC60 может быть использован в качестве средства для подавления выработки провоспалительных цитокинов.

Поскольку БА является хроническим заболеванием, по-видимому, дисфункция барьера является ведущей первичной причиной БА. Удивительно, но оказалось, что nC60 довольно заметно увеличивает экспрессию филаггрина in vivo (рис. 5). Нам не удалось найти никаких научных публикаций о влиянии фуллерена на активацию гена филаггрина, за исключением данных из презентации “Vitamin C60 BioResearch Corporation”, где комплекс C60/PVP (“Радикальная губка”) увеличивал экспрессию FLG в клетках, обработанных RS, в контрольных клетках примерно в четыре раза (http://www.novac60.com/wp-content/uploads/2013/10/VC60-Fullerene-skin-barrier-effect.pdf ). Однако эти данные еще раз указывают на потенциал фуллерена С60 в качестве стимулятора производства филагрина.

Гистологический анализ показал, что положительный терапевтический эффект был достигнут как при лечении EC, так и при SC nC60, но первое было более эффективным. Основным компонентом кожной воспалительной реакции была эозинофильная инфильтрация, и в группе “nC60 EC” наблюдалось выраженное снижение количества эозинофилов. Следует отметить, что этот результат коррелировал со снижением концентрации IL-5 в той же группе в сочетании с регенеративными процессами в коже в отличие от “AD”.

Таким образом, в этом исследовании мы продемонстрировали, что применение nC60 ингибирует воспалительный процесс и может представлять собой перспективный терапевтический подход для контроля аллергического воспаления. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять механизм активности фуллерена.

Выводы
Мы обнаружили, что nC60 значительно ингибирует выработку специфического IgE в мышиной модели AD. Кроме того, было показано, что уровни IL-4, IL-5 были значительно снижены после обработки EC и SC C60. Было замечено, что лечение EC C60 смещает иммунный ответ с Th2 на Th1, заметно увеличивая выработку IL-12 и IFN-γ. Мы также выявили, что использование nC60 в EC-пути увеличивает экспрессию Foxp3 и FLG. Таким образом, одновременное повышение экспрессии Foxp3 и филаггрина приводит к снижению восприимчивости к AD. Гистологический анализ образцов кожи показал, что терапия nC60 улучшила гистологическую картину, уменьшив аллергическое воспаление как с помощью EC, так и с помощью SC аппликаций по сравнению с необработанными мышами. Мы точно не знаем, почему применение EC более эффективно, чем SC. Возможное объяснение заключается в том, что применение ЕС с nC60 увеличивает доступность фуллерена для иммунной системы из-за присутствия большого количества иммунных клеток в коже при аллергическом воспалении (AD).

Таким образом, использование nC60 в форме аппликации EC является многообещающим альтернативным терапевтическим подходом для контроля аллергического воспаления. Точная доза для людей будет определена только на этапе клинических испытаний.


Методы
Реагенты
Овальбумин (OVA) (сорт V, 99 %) и l-аланин были приобретены у Sigma-Aldrich (США). N-метилпирролидон (NMP, 99 %) был приобретен у Panreac (Испания). Кристаллический фуллерен C60 был приобретен у SES Research (99,9 %, каталог 600-9969, США).

Препарат nC60
Водная дисперсия фуллерена nC60 была получена методом, описанным ранее [39]. Вкратце, 20 мг C60 растворяли в 25 мл N-метилпирролидона (магнитная мешалка) и полученный темно-коричнево-фиолетовый раствор смешивали с раствором 40 мг l-аланина в 100 мл деионизированной воды. Полученный темно-красный прозрачный раствор перемешивали в течение 1 ч, а затем подвергали исчерпывающему диализу (отсекали 10/50 кДа) с деионизированной водой. Конечный раствор для диализа фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану толщиной 0,45 мм, в результате чего получали прозрачный раствор коричневато-желтого цвета с концентрацией 120 мкг/мл.

Сенсибилизация мышей (модель AD) и лечение nC60
Самки мышей BALB/c в возрасте 4-6 недель были приобретены в филиале питомника животных SCBMT “Столбовая” (Московская область, Россия) и содержались в среде, свободной от патогенов, на диете, не содержащей яйцеклеток. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с приказом № 708 Министерства здравоохранения Российской Федерации и “Положением об этическом отношении к лабораторным животным НИЦ Института иммунологии ФМБА России (Москва, Россия)”.

Сенсибилизацию мышей к ЕС для индуцирования воспаления кожи проводили, как описано Spergel et al. (1998). Вкратце, мышей брили электрической бритвой. Яйцеклетки (100 мкг) в PBS (100 мкл) или PBS в качестве плацебо помещали на пластырь из стерильной марли размером 1 × 1 см2, который затем закрепляли на коже прозрачной биоклюзионной повязкой (Systagenix Wound Management Limited, Великобритания). Пластырь накладывали трижды в течение 1 недели. Проверка в конце каждого периода сенсибилизации подтверждала, что пластырь остается на месте. Лечение C60 проводилось подкожно (SC; 0,1 мг/кг) и подкожное введение nC60 (EC; 1 мг/кг), между нанесениями OVA, как показано на рис. 1.

Анализ на антитела и цитокины
Уровни антител против OVA IgE, IgG1 и IgG2a в сыворотках, полученных до, во время и после обработки nC60, определяли методом ИФА (наборы для ИФА фирмы BD, США) в соответствии с протоколом производителя. Для покрытия планшетов использовали OVA. Мышиный антиовальбуминовый IgE mAb (AbD Serotec, Великобритания) и биотиновый крысиный анти-мышиный IgE (BD) были использованы для выявления анти-OVA мышиного IgE. Эти компоненты были использованы для построения калибровочной кривой, а затем для анализа сывороток.

Селезенки брали после последнего применения аллергена, и уровни IL-4, IL-5 и IL-12 (p40) в супернатантах спленоцитов, стимулированных яйцеклетками, определяли с помощью ELISA [Набор Duo от R&D Systems (Великобритания) и набор ELISA от BD (США)] в соответствии с протоколом производителя.

ПЦР в реальном времени
Общую РНК из спленоцитов мышей, стимулированных яйцеклетками, выделяли с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, Франция) в соответствии с инструкциями производителя. Определяли концентрацию РНК и синтезировали кДНК с помощью реакции обратной транскрипции (“Реверта-Л”, Интерлабсервис, Россия). Количественный ПЦР-анализ экспрессии мРНК в режиме реального времени проводился с помощью системы iQ5 (Bio-Rad, США) и набора PCR-Mix (Синтол, Россия).

Результаты представлены в виде экспрессии мРНК (Foxp3, FLG). Расчеты для определения относительного уровня экспрессии гена были выполнены с использованием метода сравнительной компьютерной томографии (ΔΔCt), относящегося к mHPRT в каждом образце; результаты представлены в виде произвольных единиц.

Гистологический анализ
Образцы кожи с участков пластыря были взяты для гистологического исследования сразу после последнего применения ЭК с яйцеклетками. Биопсии кожи были взяты с аналогичных участков тела, зафиксированы на ночь 10%-ным параформальдегидом при температуре 4°C и залиты в парафин. Срезы размером в четыре микрометра окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Гистологические препараты анализировали под световым микроскопом (Leica DM2000, Германия) с линзами 50×, 100× и 400×.

Статистический анализ
Данные приведены в виде среднего значения ± SE. Статистический анализ проводился с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Значимость результатов определялась с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались значимыми при p < 0,05. Количественные данные ОТ-ПЦР были рассчитаны с использованием метода сравнительной компьютерной томографии (ΔΔCt).


Вклад авторов
NS, EB, IS, AN провели молекулярно-генетические исследования и иммунологические анализы. DP приготовили водный раствор C60. OK провели гистологический анализ. NS, SA, MK внесли существенный вклад в концепцию, дизайн, анализ, интерпретацию данных и дали окончательное одобрение версии для публикации. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.