Абстрактный
Избыточная выработка активных форм кислорода является основной причиной возникновения и прогрессирования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Водорастворимый первозданный фуллерен С60 является мощным и нетоксичным антиоксидантом, поэтому целью было изучение его действия на модели ГЦК у крыс и его возможных механизмов. Исследования на клетках HepG2 (HCC человека) продемонстрировали способность фуллерена C60 ингибировать рост клеток (IC50 = 108,2 мкмоль), индуцировать апоптоз, снижать активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, повышать экспрессию виментина и р53 и изменять окислительно-восстановительное состояние HepG2. При применении животным с ГЦК в дозе 0,25 мг/кг в сутки, начиная со стадии цирроза печени, фуллерен С60 улучшал выживаемость после лечения аналогично контрольному 5-фторурацилу (31 и 30 недель по сравнению с 17 неделями) и ингибировал метастазирование в отличие от последнего. Кроме того, фуллерен С60 существенно ослаблял повреждение печени и фиброз, снижал активность печеночных ферментов и нормализовал уровень билирубина и окислительно–восстановительных маркеров (повышенный в 1,7-7,7 раза при ГЦК). Таким образом, был сделан вывод о способности фуллерена C60 ингибировать рост клеток HepG2, развитие ГЦК и метастазирование, а также улучшать выживаемость животных. Цитостатическое действие фуллерена С60 может быть реализовано за счет индукции апоптоза и подавления активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в дополнение к его антиоксидантной активности.

Ключевые слова: водорастворимый первозданный фуллерен С60, гепатоцеллюлярная карцинома, клетки HepG2, окислительный стресс, 5-фторурацил, измерения ДЛС

1. введение
Рак печени является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований и занимает второе место среди причин смертности от рака в мире. Рак печени занимает четвертое место по распространенности среди мужчин после рака легких, предстательной железы и желудка, и седьмое место по распространенности среди женщин после рака молочной железы, легких, шейки матки, щитовидной железы, колоректального рака и желудка. Общая смертность от рака печени достигает 93% у лиц в возрасте от 0 до 74 лет и занимает второе место по уровню смертности от онкологических заболеваний [1]. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) — злокачественное новообразование гепатоцитарного происхождения — является одним из наиболее быстро прогрессирующих онкологических заболеваний со смертельным исходом. На ее долю приходится до 90% всех первичных злокачественных опухолей печени. В 70-80% случаев злокачественная трансформация наблюдается в цирротически измененной печени [2], а наличие цирроза значительно повышает риск развития опухоли [3].

ГЦК сложно диагностируется и имеет крайне неблагоприятный прогноз. При отсутствии адекватной терапии выживаемость пациентов с ГЦК составляет около четырех месяцев после постановки диагноза. Полная или частичная резекция и ортотопическая или полная трансплантация печени остаются идеальными методами лечения рака печени. Неинвазивные методы терапии включают трансартериальные методы (химио-, радио-, мягкая эмболизация) и абляционные методы лечения (радио-, крио-, микроволновая абляция) [4]. Стандартным химиотерапевтическим средством, рекомендуемым против этой патологии, является ингибитор тирозинкиназы сорафениб, который может блокировать серин/треонинкиназы Raf и рецепторные тирозинкиназы (рецептор вазоэндотелиального фактора роста и рецептор тромбоцитарного фактора роста). Управление по контролю за продуктами и лекарствами США недавно одобрило ингибиторы тирозинкиназы, обладающие аналогичной активностью, такие как ленватиниб, регорафениб, рамуцирумаб и пембролизумаб, в качестве первой и второй линии лечения ГЦК [3]. Однако вышеперечисленные стратегии часто неэффективны и вызывают серьезные осложнения у многих пациентов.

Рак печени развивается по типичной схеме: прогрессирующее воспаление с последующими фиброзными изменениями и развитием цирроза с последующей злокачественной трансформацией клеток печени [5]. Специфика патогенеза ГЦК, в частности прогрессирующая фиброзная дегенерация тканей печени, вызывает частое отсутствие ответа на химиотерапевтические препараты и быстрое развитие тяжелых осложнений. Одним из основных механизмов как фиброзной, так и злокачественной дегенерации печени является избыточная выработка активных форм кислорода (АФК) и ингибирование системы антиоксидантной защиты, т.е., развитие окислительного стресса. Использование природных антиоксидантов (витаминов, второстепенных аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот и растительных экстрактов) при патологиях печени, связанных с циррозом и неоплазией, рассматривалось в большом количестве исследований. Однако ни один из результатов не может рассматриваться как решение этой задачи [6]. Одним из них могли бы быть искусственные соединения с заранее заданными свойствами, поскольку они не участвуют в многочисленных клеточных метаболических путях и, таким образом, позволяют целенаправленно влиять на конкретные жизненные процессы [7]. Биосовместимый водорастворимый первозданный фуллерен С60 обладает уникальными физико-химическими свойствами, которые позволяют ему эффективно удалять свободные радикалы, т.е. быть антиоксидантом и, таким образом, проявлять противовоспалительную и противоопухолевую активность [8,9,10,11].

Кроме того, фуллерен С60 нетоксичен при использовании в терапевтических дозах и может накапливаться в печени [12,13], что делает привлекательным воздействие на нее. Следовательно, эта наночастица является идеальным кандидатом для профилактики и лечения заболеваний печени, связанных с окислительным стрессом. Таким образом, целью было изучение влияния водорастворимого первичного фуллерена С60 на состояние печени крыс, перенесших ГЦК, и возможных механизмов его воздействия. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: (1) Оценить влияние фуллерена С60 на морфологию и функцию печени, выживаемость животных и метастазирование, а также его безопасность, для выявления эффективности фуллерена С60 в качестве средства против ГЦК; (2) оценить окислительно-восстановительные состояния всей печени и только злокачественные клетки печени для определения того, может ли антиоксидантная способность фуллерена С60 способствовать его терапевтической эффективности; (3) предположить влияние фуллерена С60 на жизнеспособность клеток гепатомы и экспрессию/активность основных белков, ответственных за выживание злокачественных клеток и метастазирование (р53, виментин, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа), для выяснения механизмов противоопухолевого действия фуллерена С60.

Идти к:
2. Материалы и методы
2.1. Приготовление и характеристика чистого водного коллоидного раствора фуллерена C60 (C60FAS)
Высокостабильный первичный водный коллоидный раствор фуллерена C60 (C60FAS; чистота >99,5%, концентрация 0,15 мг/мл) был приготовлен в соответствии с оригинальным методом [14,15]. Вкратце, он был основан на переводе фуллерена C60 из толуола в водную фазу с помощью ультразвуковой обработки. Полученный C60FAS стабилен в течение 12 месяцев при температуре +4°C [16].

Измерения динамического светорассеяния (DLS) и дзета-потенциала были проведены для определения гидродинамического размера и электрокинетического потенциала приготовленных C60FAS с использованием метода Zetasizer Nano-ZS90 (Малверн, Вустершир, Великобритания). Полученные результаты были оценены с использованием приближения Смолуховского, которое строго справедливо только для сферообразных частиц.

2.2. Анализы In Vitro
Клеточная линия HepG2 была получена в Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого Национальной академии наук Украины. Клетки культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% CO2, влажность 95%) в модифицированной среде Eagle фирмы Dulbecco (DMEM, Merck, Дармштадт, Германия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Merck, Германия), 2 мм L-глютамина (Merck, Германия). и 40 мг/мл гентамицина (Биофарма, Киев, Украина).

2.2.1. Анализы жизнеспособности клеток и апоптоза Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (MTT) (Abcam, Кембридж, Великобритания). Клетки высевали на стекло с покрытием в 96-луночные планшеты с плотностью 6 × 103 клеток на лунку и использовали в течение 24 ч культивирования. Затем клетки инкубировали в среде, содержащей 1% PBS и 1, 10 или 100 мкг/мл C60FAS или 1 и 10 мкг/мл доксорубицина (Dox, Ebewe Pharma, Унтерах-ам-Аттерзее, Австрия) в качестве эталона, в течение 48 ч, и после этого проводили МТТ-анализ в соответствии с набором производителя (Abcam, Великобритания). Значения абсорбции при различных концентрациях были нормализованы до среднего контрольного значения в соответствии с протоколом производителя.
Гибель клеток оценивали с помощью анализа апоптоза аннексина V/йодида пропидия (AnV/PI). Клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 0,7 × 106 клеток на лунку и инкубировали в среде без сыворотки, содержащей 1, 10 или 100 мкг/мл C60FAS, в течение 48 ч, затем проводили анализ апоптоза в соответствии с набором производителя (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США). Пропорции живых, мертвых клеток и клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза, измеряли методом проточной цитометрии (FACS Calibur, Бектон Дикенсон, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), образцы анализировали с использованием программного обеспечения CellQuest версии 5.1 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).

2.2.2. Иммуногистохимический анализ Для оценки экспрессии виментина и р53 клетки высевали на стекло с покрытием в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 104 клеток/см2 и использовали в течение 48 ч культивирования. Клетки инкубировали в среде, содержащей 10 или 100 мкг C60FAS на мл, в течение 48 ч. Эти концентрации были выбраны как те, которые демонстрируют существенное влияние на рост клеток и апоптоз. Иммуногистохимический анализ проводили с использованием первичных моноклональных антител к виментину и р53 и наборов реагентов для иммуногистохимической визуализации в соответствии с протоколами, предоставленными производителями. Мы использовали следующие антитела: анти-vim—клон V9 IS630 (Dako, Карпинтерия, Калифорния, США), анти-p53—DO-1 sc-126 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США). Кроме того, образцы окрашивали гематоксилином (Merck, Германия) для визуализации ядер.
Количество иммунопозитивных клеток подсчитывали в 10 случайных микроскопических полях зрения для каждого образца с использованием стандартной шкалы измерения (объект-микрометр) при одинаковом увеличении и рассчитывали в процентах от общего числа клеток, принятого за 100%. Использовались световой микроскоп Olympus BX-41 (Olympus Europe GmbH, Мюнхен, Германия) и камера Olympus C-5050 Zoom (Olympus Europe GmbH, Германия) с соответствующим программным обеспечением (Olympus DP Soft 3.2, Olympus Europe GmbH, Германия). Было подсчитано по меньшей мере 200 клеток. Интенсивность окрашивания клеток оценивали с использованием следующей шкалы: 0—отрицательная, 1— слабая; 2 — умеренная; 3—сильная. Гистологический балл (H-score) рассчитывали следующим образом: H-score = 1 × %% слабо окрашенных клеток + 2 × %% умеренно окрашенных клеток + 3 × %% сильно окрашенных клеток [17].

2.2.3. Биохимические анализы Клетки HepG2 культивировали в стандартных условиях в среде, содержащей C60FAS (10 или 100 мкг/мл), в течение 48 ч. Затем клеточную среду, содержащую C60FAS, удаляли, клетки промывали свежей (3 раза) и замораживали и размораживали для уничтожения; образцы несколько раз пропускали через иглу шприца среднего диаметра для гомогенизации. Чтобы оценить влияние C60FAS на окислительно-восстановительное состояние клеток, мы измерили малоновый диальдегид (MDA), карбонильные группы белка (PCG), уровни восстановленного глутатиона (GSH) и активность каталазы (CAT), супероксиддисмутазы (SOD), глутатион-S-трансферазы (GST) и глутатионпероксидазы (GP) в образцы. Для оценки энергетического метаболизма клеток измеряли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD). Общий белок оценивали с использованием стандартного набора реагентов (DiagnosticumZrt, Будапешт, Венгрия). Активность ферментов и содержание низкомолекулярных веществ выражали в пересчете на мг белка.

2.3. Анализ на животных
Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Вистар, которые содержались в виварии Киевского национального университета имени Тараса Шевченко. Месячных крыс с начальной массой тела 120 ± 10 г случайным образом распределили по 8 животных в пластиковой клетке на подстилке из древесной стружки хвойных пород; всего в эксперименте было использовано 80 животных. Крыс содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и 50%-ной влажности при температуре 20-22°C и кормили стандартной диетой и водопроводной водой в неограниченном количестве. Все эксперименты проводились в соответствии с принципами биоэтики, законодательными нормами и положениями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 1986), Общими этическими принципами проведения экспериментов на животных, принятыми Первым Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2001), а также одобрен институциональным комитетом по обзору (Сертификат этического одобрения проекта № 18BF036-01M (грант MESU № 0118U000244) предоставлено Комитетом по биоэтике Учебно-научного центра “Институт биологии и медицины” Киевского национального университета имени Тараса Шевченко 15 июля 2019 года).

2.3.1. Дизайн исследования ГЦК моделировали путем начальной внутрибрюшинной инъекции N-диэтилнитрозамина (DEN, 200 мг/кг) (Merck, Германия) в физиологическом растворе (общий объем 0,1 мл на крысу). Через 2 недели были начаты подкожные инъекции четыреххлористого углерода (CCl4, 1 мл/кг) (Биофарма, Украина) в подсолнечном масле (общий объем 0,2–0,7 мл на крысу в зависимости от массы тела) с последующим введением в течение 20 недель для стимуляции процесса регенерации. В течение первых 10 недель мы делали по 3 инъекции в неделю, затем по 2 инъекции в неделю. Изменения в печени соответствуют прогрессирующему фиброзу и циррозу печени (8-12 недель от начала исследования, т.е. введению DEN), злокачественной дегенерации клеток печени (14-16 недель от начала исследования) и множественным хорошо развитым опухолям печени с метастазами (20-22 недели) [18,19]. C60FAS вводили ежедневно внутрибрюшинно в объеме, соответствующем дозе фуллерена С60 0,25 мг/кг (0,3–0,6 мл на крысу в зависимости от массы тела), которая считается безопасной и эффективной, о чем свидетельствуют наши предыдущие исследования [8,9,20]. Введение было начато на 16-й неделе эксперимента (стадия цирроза и злокачественной дегенерации клеток, что подтверждено нашим предыдущим исследованием [21]) и продолжалось в течение 7 недель для изучения влияния C60FAS на развитие опухолей печени и метастазов. В качестве эталона мы используем распространенный противоопухолевый препарат 5-фторурацил (5FU, Ebewe Pharma, Австрия). 5FU вводили внутрибрюшинно еженедельно в физиологическом растворе в дозе 15 мг/кг (общий объем 0,1 мл на крысу) в течение 7 недель, начиная с 16-й недели эксперимента. Вместо этого группы сравнения индуцировали соответствующими растворителями. Экспериментальные группы (n = 16) были следующими: (1) Контрольная, (2) C60FAS, (3) HCC, (4) HCC + C60FAS, (5) HCC + 5FU. Схема исследования изображена на рисунке 1.
Через 24 ч после последней дозы половины животных из каждой группы (выбранных случайным образом) умерщвляли путем вдыхания CO2 и последующего смещения шейки матки. Другие половины оставляли без какого-либо лечения для теста на выживаемость.

2.3.2. Анализ выживаемости Половинки животных из каждой экспериментальной группы (n = 8) наблюдались в течение следующих 32 недель без какого-либо лечения для оценки выживаемости; мертвых животных препарировали и регистрировали метастазы, если таковые имелись. Через 54 недели после начала эксперимента животных, которые все еще были живы, умерщвляли и регистрировали метастазы. Данные о выживаемости оценивали с помощью анализа Каплана–Мейера, рассчитывали медианное время выживаемости после лечения и строили кривые выживаемости.
2.3.3. Анализы крови Для проведения биохимических анализов мы брали кровь сразу после забоя из бедренной вены, оставляли ее на 20 мин для образования сгустка, а затем центрифугировали 10 мин при 1500×g. Сыворотку крови собирали и немедленно использовали. Мы определили следующие сывороточные маркеры с использованием стандартных наборов реагентов (DiagnosticumZrt, Венгрия): аланинаминотрансферазу (АЛТ), аспартатаминотрансферазу (АСТ), щелочную фосфатазу (ЩФ), ЛДГ, активность α-амилазы, содержание общего белка, общего (конъюгированного + неконъюгированного) и прямого (конъюгированного) билирубина, мочевина, креатинин и триглицериды.
2.3.4. Гистологические анализы Образцы печени, почек, селезенки и поджелудочной железы отбирали сразу после умерщвления и фиксировали в смеси Буина в течение 7 дней. Затем их заливали в парафин, нарезали ломтиками толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E, Merck, Германия) в соответствии со стандартным протоколом [22]. Мы использовали следующие реагенты: хлороформ, формалин, парафин, этанол (Biopharma, Украина), гематоксилин, эозин, orange G (Merck, Германия). Возможные повреждения были исследованы под световым микроскопом (Olympus BX-41, Olympus Europe GmbH, Германия) двумя независимыми патологоанатомами, которые не знали о группе лечения.
2.3.5. Анализы печени Вскрытия печени оценивались по следующей шкале [23]: 0 —печень красновато-коричневая, мягкой консистенции и гладкой поверхности; 1 —печень увеличена, мягкой и рыхлой консистенции; 2 —печень гиперемирована; 3 —печень увеличена с редкими белыми очагами некроза; 4—печень увеличена с множественными белыми очагами некроза; 5—стеатоз печени, проявляющийся увеличенной, желтой, мягкой и жирной печенью; 6—печень среднего или увеличенного размера и пятнисто—красная с участками, окрашенными желчью; 7-печень содержит видимые узелки; 8—микроузловой фиброз, сопровождающийся увеличением желтой жировой ткани печени; 9 —макроузловой фиброз и цирроз печени, сопровождающиеся сморщенной коричневой нежирной печенью; 10-в эксплантированной печени присутствуют мелкие единичные зернистые тельца; 11—в эксплантированной печени присутствуют крупные единичные зернистые тельца; 12—много мелких зернистых телец представлено в эксплантированной печени; 13—в эксплантированной печени представлено много крупных зернистых тел.
С помощью световой микроскопии рассматривалась типичная или атипичная гистологическая структура печени, оценивались и анализировались форма, строение и окрашивание клеток, стромы и инфильтрация ткани железы лейкоцитами и сосудистой сетью. Тяжесть фиброза оценивали по шкале фиброза Ишака [24]: 0— признаков фиброза нет; 1—фиброзное расширение некоторых портальных областей, могут возникать короткие фиброзные септики; 2—фиброзное расширение большинства портальных областей, могут возникать короткие фиброзные септики; 3—фиброзное расширение большинства портальных областей, разделы , связывающие портал с порталом, встречаются время от времени; 4—фиброзное расширение большинства портальных областей, преобладают септальные образования, соединяющие портал с порталом, также встречается портально–центральный мостик; 5–фиброзные септальные образования распространены и хорошо развиты, узелки встречаются редко; 6— цирроз печени.

Остатки печени промывали физиологическим раствором с последующим добавлением забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, рН 7,0), содержащего 1 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и 0,4 мм фенилметилсульфонилфторида (PMSF, ингибитор сериновых протеаз) (Thermo Fisher Scientific, США), и быстро замораживали при температуре -70°C. После размораживания образцы гомогенизировали в PBS, содержащем 1 мм ЭДТА и 0,4 мм PMSF, с помощью ручного гомогенизатора, фильтровали через четыре слоя марли и центрифугировали (10 000× g, 15 мин) для осаждения ядер и митохондрий. Супернатанты собирали и использовали для анализа немедленно — весь цикл от размораживания до анализа проводился в тот же день. Содержание MDA, PCG и GSH, а также активность внутриклеточных SOD, CAT, GP и общего GST, служивших маркерами окислительно-восстановительного состояния печени, измеряли спектрофотометрически и выражали в пересчете на мг белка. Общий белок оценивали с использованием стандартного набора реагентов (DiagnosticumZrt, Венгрия).

2.4. Ферментативные анализы
Перекисное окисление липидов оценивали на основе способности его конечного продукта MDA вступать в реакцию с тиобарбитуровой кислотой и образовывать окрашенный триметиновый комплекс, имеющий максимальное поглощение при 532 нм. Тест проводили, как описано в [25], использовали молярный коэффициент экстинкции, равный 1,56 × 105 М−1·см−1.

Окисление белка оценивали в соответствии с [26], когда окисленные аминокислотные остатки вступают в реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием стабильного продукта 2,4-динитрофенилгидразона. Степень 2,4-динитрофенилгидразона определяли при 370 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, равного 2,2 × 104 М−1·см−1.

Содержание GSH оценивали по способности 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты окислять GSH до дисульфида глутатиона и 5-тио-2-нитробензойной кислоты, имеющей максимальное поглощение при 412 нм [27]. Содержание GSH определяли количественно с использованием калибровочной кривой.

Активность СОД оценивали на основе его способности ингибировать фоторедукцию нитросинего тетразолия (NBT), как описано в [28]. Реакцию инициировали ярким солнечным светом в течение 10 мин и останавливали добавлением 1% йодида калия; поглощение измеряли при 540 нм. 1 единицу активности СОД определяли как количество фермента, необходимое для того, чтобы вызвать 1%-ное ингибирование скорости фоторедукции NBT.

Активность CAT оценивалась на основе его способности расщеплять H2O2 и, таким образом, уменьшать образование окрашенного продукта в реакции между H2O2 и солью молибдена. Тест проводили в соответствии с [29], поглощение хромогена определяли при 410 нм, использовали молярный коэффициент экстинкции 22,2 М−1·см−1.

Активность GP оценивали путем измерения неиспользованного GSH в реакции с гидропероксидом трет-бутила с использованием в качестве субстрата [30]. Содержание GSH определяли, как описано выше.

Общую активность GST оценивали по его способности переводить GS-группу в 1-хлор-2,4-динитробензол. Тест проводили в соответствии с [31], поглощение хромогена определяли при 340 нм, использовали молярный коэффициент экстинкции 9600 М−1·см−1.

Активность G6PD оценивали по его способности окислять глюкозо-6-фосфат до 6-фосфоглюконолактона при одновременном восстановлении никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADP+) до NADPH, что сопровождается увеличением поглощения при 340 нм. Использовался молярный коэффициент экстинкции, равный 6220 М−1·см−1 [32].

Активность ЛДГ оценивали по его способности окислять никотинамидадениндинуклеотид Н (NADH) при восстановлении пирувата до лактата (обратная реакция), что сопровождается снижением поглощения при 340 нм. Использовался молярный коэффициент экстинкции, равный 6220 М−1·см−1 [33].

Использовались следующие реагенты: ледяная уксусная кислота, метанол, трет-бутанол, пиридин, трет-бутилат натрия, гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия, трохлоруксусная кислота, соляная кислота, этилацетат, этанол, мочевина, йодид калия, молибдат аммония, H2O2 (Биофарма, Украина), тетраметилэтилендиамин (Термо Fisher Scientific, США), тиобарбитуровая кислота, NBT, рибофлавин (Merck, Германия).

2.5. Статистический анализ
Анализ данных проводился с использованием программного пакета SPSS 23.0 для Windows. Распределение данных оценивалось с помощью теста Колмогорова-Смирнова на одной выборке. Статистический анализ данных проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием post hoc-теста Тьюки, если данные были распределены нормально, в противном случае применялся критерий Манна–Уитни. Данные о выживаемости анализировались методом Каплана–Мейера, а для сравнения различных методов лечения использовался критерий Бреслоу. Разница считалась статистически значимой при р < 0,05.

3. Результаты
3.1. Характеристика C60FAS
Известно, что агрегация и стабильность частиц фуллерена C60 в воде влияют на биодоступность и токсичность для организма [34,35,36,37]. Таким образом, приготовленный C60FAS (концентрация 0,15 мг/мл) был охарактеризован методом DLS.

Метод DLS показал, что C60FAS содержит одиночные молекулы C60 (0,72 нм), а также их агрегаты размером до 100 нм, что хорошо согласуется с расчетами [38]. Кроме того, стабильность использованного C60FAS оценивалась путем измерения дзета-потенциала. Было показано, что это значение составляет -25,4 мВ при комнатной температуре. Такой высокий (по абсолютной величине) дзета-потенциал для протестированного C60FAS указывает на высокую стабильность (низкую тенденцию к агрегации наночастиц с течением времени) и его пригодность для дальнейших биологических исследований.

3.2. Анализы на HepG2
Изучая влияние C60FAS на клетки HepG2 (HCC человека), мы наблюдали угнетение жизнеспособности клеток фуллереном C60. Мы определили IC50 как 77,9 мкг/мл (соответствует 108,2 мкмоль) (рис. 2), что позволяет нам сделать вывод о его умеренной токсичности [39,40]. Действительно, 5FU IC50 для этих клеток равен 323 мкмоль, тогда как Dox one — всего 1,1 мкмоль [41]. Следовательно, мы могли бы предположить, что фуллерен C60 является скорее цитостатическим агентом для клеток HepG2, чем цитотоксическим. Далее мы определили, способствует ли апоптоз ингибированию выживания клеток C60FAS. Мы наблюдали дозозависимое увеличение пула клеток с ранним и поздним апоптозом и отсутствие изменений в пуле некротических клеток после инкубации с C60FAS (рис. 2). Таким образом, мы могли бы сделать вывод о способности C60FAS индуцировать апоптоз в клетках HepG2 при применении в высоких дозах (>10 мкг/мл).
Изучая влияние C60FAS на экспрессию виментина и p53 в клетках HepG2, мы обнаружили, что фуллерен C60 стимулирует экспрессию обоих (рис. 3). Таким образом, H-баллы для виментина и р53 увеличивались дозозависимым образом на 93-183% и 73-86% соответственно (таблица 1).
Мы наблюдали, что фуллерен C60 ингибировал активность G6PD дозозависимым образом вплоть до почти полного блокирования при культивировании в максимальной концентрации (100 мкг/мл). В то же время активность LDH повышалась (до 64%). Изменения маркеров окислительно-восстановительного состояния HepG2 были неоднозначными. Наблюдалось увеличение активности СОД до 93% и снижение PCG до 94% (что свидетельствует об уменьшении окислительного стресса) одновременно с подавлением CAT, GST, GP и GSH (на 22-46%) и повышением MDA до 6,5 раз (признаки окислительного стресса). (Таблица 1). Более того, изменения СОД, МДА и ЛДГ не зависели от дозы, вероятно, из-за различных механизмов действия различных (на порядок) доз фуллерена С60.

3.3. Анализ выживаемости
Анализ выживаемости после лечения продемонстрировал увеличение медианы выживаемости животных, подвергшихся воздействию 5FU и C60FAS, соответственно, на 76% и 82% по сравнению с животными, не получавшими лечения (рис. 4, таблица 2).
Более того, анализируя результаты вскрытия и слайды поджелудочной железы, мы не наблюдали атипичных клеток в поджелудочной железе на 22-й и 54-й неделе в группе C60FAS, но хорошо развитые метастазы на 54-й неделе в группе 5FU. Напротив, у животных, не получавших лечения, наблюдались скопления неопластических клеток и даже хорошо развитые опухоли на 22-й неделе и массивные метастазы на 54-й неделе (рисунок S1).

3.4. Анализы печени
У здоровых животных, получавших C60FAS в течение 7 недель, не было выявлено никаких изменений в общем внешнем виде, морфологии печени, почек, поджелудочной железы и селезенки и маркерах сыворотки крови, за исключением повышения уровня триглицеридов (до 2,2 раза) и снижения активности α-амилазы (до 3,7 раза), что указывает на возможную дисфункцию поджелудочной железы (таблица 2, рисунки S1–S4). Окислительно-восстановительное состояние печени также не изменилось (таблица 3).
У животных с ГЦК, не получавших лечения, в печени наблюдались множественные светлые узлы разного размера на фоне цирроза (рис. 5). Печень была темной, что указывало на застой крови. Микроскопические исследования выявили хорошо развитый цирроз и очаги гипертрофированных гепатоцитов с потерей зернистости цитоплазмы, что может свидетельствовать о очаговой узловой гиперплазии или гепатоцеллюлярной аденоме [42]. Мы также наблюдали локусы высокоразвитого ГЦК (вероятно), дистрофические изменения цитоплазмы гепатоцитов (эозинофильные изменения), увеличенные ядра с деконденсированным хроматином (что свидетельствует о повышенной активности) (рис. 5). Расширенные и переполненные сосуды могут свидетельствовать о портальной гипертензии. Наблюдалось значительное повышение содержания конъюгированного и неконъюгированного билирубина (в 2,7 и 2,17 раза соответственно), общего белка (на 33%), АСТ (на 74%) и ГГТ (в 4,8 раза) в сыворотке крови, остальные маркеры оставались на контрольном уровне (табл. 2). Массивное замещение паренхимы печени фиброзной и опухолевой тканью может объяснить отсутствие повышения АЛТ, ЩФ и ЛДГ из-за уменьшения количества полностью функционирующих гепатоцитов и, соответственно, значений вышеуказанных ферментов в пределах нормы. Исследование поджелудочной железы с помощью световой микроскопии выявило отек, переполнение кровеносных сосудов, замещение ткани фиброзом при некоторых вскрытиях. Почки и селезенка, вероятно, не изменились (рисунки S3 и S4).
MDA и PCG ткани печени имели тенденцию к повышению (в 3,7 и 3,9 раза соответственно), что свидетельствует об окислительном стрессе. Однако активность антиоксидантных ферментов и GSH также увеличились (в 1,9–7,7 раза) (Табл. 3), что может быть признаком адаптации опухоли к окислительному стрессу и довольно типично для ГЦК [43,44].

Печень животных с ГЦК, получавших 5FU, в значительной степени соответствовала печени необработанных животных и демонстрировала множественные светлые узлы разного размера и признаки цирроза. Цвет печени был светлым (желтоватым) или темным (рис. 5). Микроскопические исследования, однако, выявили значительное уменьшение цирротических изменений (на 40% по шкале Ишака): межпортальные перегородки были тонкими с неизмененной архитектурой ткани печени между ними, часто фиброзное разрастание ограничивалось только портальными участками. Тем не менее, также имели место эозинофильные изменения гепатоцитов, признаки портальной гипертензии, очаговой узловой гиперплазии и аденомы (рис. 5). Уровни конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови у крыс с ГЦК + 5FU были ниже по сравнению с животными с ГЦК без лечения (на 43% и 32% соответственно), оставаясь, однако, выше, чем в контроле (на 56% и 49% соответственно). АСТ и ГГТ оставались повышенными, активность α-амилазы снижалась (на 55%) (таблица 2). Уровни PCG и MDA печени у крыс с ГЦК + 5FU были снижены по сравнению с крысами с ГЦК, не получавшими лечения (на 41% и 53% соответственно, оставаясь повышенными по сравнению с контролем на 130% и 72%), а также ферменты антиоксидантной защиты и GSH (на 36-89% по сравнению с необработанными животных, изменились незначительно по сравнению с контролем) (таблица 3). Наблюдаемые изменения могут свидетельствовать о нормализации окислительно-восстановительного состояния печени после лечения 5FU, что, вероятно, связано с общим улучшением состояния органа. Поджелудочная железа, почка и селезенка были без существенных изменений, о чем свидетельствует гистологическое исследование (рисунки S3 и S4).

Печень крыс, получавших C60FAS, у которых наблюдался ГЦК, была увеличена, желтоватая, с гладкими краями. Наблюдались признаки фиброза, проявляющиеся одиночными или множественными мягкими узлами (рис. 5). Микроскопическое исследование продемонстрировало значительное подавление цирротических изменений (на 35% по шкале Ишака): межпортальные перегородки были тонкими с неизмененной архитектурой ткани печени между ними, часто фиброзное разрастание ограничивалось только портальными участками без соединительных мостиков. Однако также имели место очаги эозинофильных и базофильных изменений и признаки портальной гипертензии (рис. 5). Уровень конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови у крыс HCC + C60FAS был выровнен (в отличие от группы 5FU). АСТ оставался повышенным у животных с ГЦК. ГГТ у крыс с ГЦК + C60FAS также был выше, чем в контроле (в 4 раза); однако он имел тенденцию к снижению по сравнению с группой с ГЦК. Мы обнаружили увеличение уровня триглицеридов в сыворотке крови по сравнению как с контрольной, так и с ГЦК-группой (в 2,8 и 3,16 раза соответственно), а также снижение уровня α-амилазы (на 90%) у животных с ГЦК, получавших C60FAS (таблица 2). Последнее может быть связано с неблагоприятным воздействием С60 на поджелудочную железу и нарушениями углеводного обмена. Однако в структурах поджелудочной железы, почек и селезенки не наблюдалось существенных изменений (рисунки S3 и S4). Животные, получавшие HCC + C60FAS, а также животные, получавшие HCC + 5FU, продемонстрировали снижение MDA и PCG (на 74% и 27% соответственно) по сравнению с крысами, не получавшими HCC. MDA нормализовался, тогда как PCG оставался повышенным в 2,8 раза по сравнению с контролем. Маркеры антиоксидантной защиты у крыс с HCC + C60FAS были выровнены (и снижены по сравнению с группой с HCC на 57-82%) (таблица 3). Следовательно, введение C60FAS способствовало нормализации окислительно-восстановительного состояния печени.

Идти к:
4. Обсуждение
Мы показали, что фуллерен С60 оказывает вероятное цитостатическое действие на клетки HepG2, увеличивает пул апоптотических клеток дозозависимым образом и усиливает экспрессию проапоптотического белка р53. Поскольку р53 является одним из основных проапоптотических белков, а фуллерен С60, как было показано, индуцирует экспрессию р53 [45], мы предполагаем, что сверхэкспрессия р53 может способствовать цитостатическому эффекту фуллерена С60 на клетки HepG2 посредством индукции апоптоза. Однако при применении в дозах менее 10-20 мкг/мл (в зависимости от клеточной линии) фуллерен С60 не увеличивал количество апоптотических и предапоптотических клеток [46], являясь, следовательно, относительно малотоксичным. Низкая цитотоксичность фуллерена С60 в отношении нормальных и неопластических клеток была также продемонстрирована в работах [13,47]. Таким образом, фуллерен C60 не влиял на жизнеспособность лейкозных клеток при применении в дозах 3,6–144 мкг/мл (клетки CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16), IC50 для клеток HEK293 был равен 383,4 мкг/мл.

Удивительно, но, несмотря на развитие фиброза и ГЦК и уменьшение метастазирования in vivo, мы наблюдали повышенную экспрессию виментина в клетках HepG2, вызванную C60FAS. Известно, что повышенная регуляция виментина является маркером эпителиально-мезенхимального перехода, который указывает на увеличение способности опухолевых клеток мигрировать и инвазировать и, следовательно, способности опухоли к метастазированию [48]. Более того, активированные звездчатые клетки печени при фиброзе печени характеризуются сверхэкспрессией виментина, что указывает на их мезенхимальный фенотип [49]. В то же время было показано, что клетки HepG2 при воздействии липополисахарида обнаруживают повышенную экспрессию и расщепление виментина, а также повышенную скорость апоптоза [50]. Кроме того, в работе [51] была показана повышенная экспрессия виментина в облученных ультрафиолетом фибробластах кожи с последующим усилением апоптоза клеток, и в качестве стимулов этого был предложен запускаемый каспазой протеолиз виментина. Кроме того, в исследовании [52] было описано участие виментина в апоптозе клеток, индуцированном фактором некроза опухоли-α. Более того, Li et al. [53] сконструировали клетки HepG2, высоко экспрессирующие виментин, и наблюдали снижение жизнеспособности и инвазивности клеток. Поскольку они оценивали только долю живых клеток, возможно, что усиленный клеточный апоптоз способствует снижению количества клеток. Мы обнаружили, что C60FAS индуцирует апоптоз в клетках HepG2, поэтому мы можем предположить, что повышенная регуляция виментина может быть связана с этим. Поскольку C60FAS при применении при ГЦК ингибирует развитие опухоли и метастазирование, мы могли бы предположить, что фуллерен C60 вряд ли индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход in vivo (по крайней мере, при применении в тестируемой дозе в течение 7 недель), а скорее вызывает апоптоз опухолевых клеток. Более того, принимая во внимание, что фуллерен С60 ингибирует прогрессирование фиброза печени, мы могли бы предположить, что он вряд ли способствует активации звездчатых клеток печени, но вместо этого может подавлять их жизнеспособность. Кроме того, способность фуллерена С60 ингибировать фиброз и цирроз печени была продемонстрирована в наших предыдущих результатах [20,21]. Между тем, полученные результаты in vitro противоречивы и требуют дальнейшего изучения.

Согласно нашим данным, фуллерен C60 ингибировал активность G6PD в клетках HepG2 вплоть до почти полного блокирования дозозависимым образом. G6PD является первым и ключевым ферментом, контролирующим скорость пентозофосфатного пути (PPP), который обеспечивает рибозу и NADPH, поддерживающие биосинтез и антиоксидантную защиту [54]. Таким образом, G6PD высоко экспрессируется в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Подавление активности этого фермента приводит к ингибированию пролиферации клеток и их апоптотической гибели, особенно в условиях окислительного стресса. Вот почему угнетение G6PD является одной из потенциальных стратегий ингибирования роста опухоли и преодоления лекарственной устойчивости [55]. Поскольку ингибирование G6PD является наиболее ярким событием по сравнению с другими наблюдаемыми биохимическими изменениями в клетках HepG2 после культивирования с C60FAS, мы можем предположить, что изменения окислительно-восстановительного баланса, а именно увеличение MDA и снижение CAT, GST, GP и GSH, могут быть следствием нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза клеток HepG2. Однако мы предполагаем, что способность фуллерена C60 ингибировать активность G6PD вносит значительный вклад в цитостатическое действие наночастицы, которое происходит не за счет индукции окислительного стресса, а за счет депривации продукта PPP. Действительно, если мы сравним влияние C60FAS на окислительно-восстановительное состояние клеток HepG2 и HCC-животных и примем во внимание, что для опухолевых клеток характерен незначительный окислительный стресс, мы наблюдаем сходные изменения в окислительно-восстановительных маркерах. В обоих случаях были снижены продукты перекисного окисления липидов и белков, а также активность ферментов антиоксидантной защиты и содержание GSH. Последнее становится ясным, когда мы вспоминаем, что система антиоксидантной защиты в раковых клетках сверхактивируется в ответ на стресс [43,44], что согласуется с нашими результатами in vivo. Таким образом, как in vitro, так и in vivo C60FAS, вероятно, изменяет окислительно-восстановительное состояние на “нормальное” и неопухолевое: подавляет перекисное окисление липидов и уменьшает вызванную стрессом сверхактивацию антиоксидантных ферментов. Однако, несмотря на то, что активность СОД была восстановлена до контрольной в исследовании in vivo, результаты in vitro продемонстрировали значительное повышение активности фермента. Это может быть объяснено вероятным различным воздействием фуллерена С60 на изоферменты СОД. Таким образом, Cu/ZnSOD преимущественно локализован в цитозоле и необходим для регуляции цитоплазматического H2O2. Напротив, MnSOD является митохондриальным ферментом и необходим для поддержания целостности и функций митохондрий, а также для поддержания метаболического переключения с митохондриального дыхания на гликолиз (эффект Варбурга) [56]. В работе [57] авторы объяснили наблюдаемую способность C60FAS уменьшать сверхактивацию MnSOD за счет стабилизации митохондриальной мембраны и, таким образом, предотвращения “утечки” MnSOD из митохондрий в цитозоль. Поскольку мы оценили общую активность СОД в гомогенате клеток HepG2 и цитозольной фракции печени ГЦК (после отделения большей части митохондрий), мы могли бы предположить, что наблюдаемое общее снижение СОД в образцах ГЦК является результатом сохранения MnSOD в митохондриях и, таким образом, его удаления из тестируемых супернатантов. Однако эта тема нуждается в дальнейшем исследовании.

Мы продемонстрировали ослабление повреждения печени вследствие действия C60FAS и значительное подавление ее фиброзной дегенерации на модели ГЦК in vivo и отсутствие признаков токсичности в отношении других жизненно важных органов (почек, селезенки). Однако C60FAS может влиять на функцию поджелудочной железы, о чем свидетельствуют показатели α-амилазы и триглицеридов в сыворотке крови. Стоит отметить, что неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) часто сопровождает недостаточность поджелудочной железы; более того, низкий уровень α-амилазы в сыворотке крови в значительной степени связан с НАЖБП независимо от сопутствующих патологий [58,59]. Таким образом, поджелудочную железу можно рассматривать как орган, наиболее чувствительный к фуллерену С60, что согласуется с нашими предыдущими исследованиями [20], и поэтому должно быть тщательно проанализировано при исследовании биологической активности этой наночастицы.

Известно, что хроническое воспаление, сопровождающееся избыточной выработкой АФК и угнетением системы антиоксидантной защиты и, следовательно, окислительным стрессом, лежит в основе подавляющего большинства заболеваний печени, включая фиброз, цирроз и неоплазию [6,60]. Действительно, было показано, что многие антиоксиданты подавляют как хроническое воспаление печени, так и его последствия, включая фиброз, цирроз печени и неоплазию [61]. Они могли бы реализовывать свою активность посредством прямого удаления АФК или модуляции АФК-зависимых сигнальных путей, включая предотвращение и усиление АФК [62], ингибирование NADPH-оксидаз [63], Wnt [64], NF-κB [65] и передачу сигналов цитокинов [66,67], активацию системы антиоксидантной защиты [68]. Однако часто бывает трудно определить конкретный механизм действия химического вещества, поскольку в большинстве случаев действие антиоксидантов является сложным и включает как поглощение АФК, так и модуляцию одного или нескольких АФК-зависимых сигнальных путей. Более того, часто антифибротическая или противовоспалительная активность вещества напрямую не связана с подавлением АФК-зависимой передачи сигналов. Однако оно влияет на окислительно-восстановительное состояние клеток из-за тесной взаимосвязи с многочисленными другими сигналами. Например, было показано, что ингибиторы рецепторов фактора роста проявляют противовоспалительную и антифибротическую активность, а также проявляют антиоксидантную [69,70]. Хотя доказанных антифибротических средств не существует, проводятся многочисленные исследования с целью выявления новых и установления антифибротической активности для популярных методов лечения заболеваний печени, сопровождающихся ее фиброзной дегенерацией [71]. Множество исследований выявили профилактический эффект природных антиоксидантов против ГЦК [72,73]. Однако простые поглотители свободных радикалов продемонстрировали недостаточную эффективность, вероятно, из-за компенсаторных систем клеток и сложной сети сигнальных путей, предназначенных для обеспечения выживания и пролиферации опухолевых клеток. Следовательно, внимание должно быть сосредоточено на соединениях, влияющих на провоспалительные, апоптотические, выживающие и пролиферативные сигнальные пути в дополнение к прямой антиоксидантной активности [72]. Действительно, было показано, что фуллерен C60 обладает мощной антиоксидантной активностью из-за удаления свободных радикалов [74,75], а также может модулировать экспрессию p53 и активность G6PD и индуцировать апоптоз при применении в относительно высоких дозах. Более того, было показано, что фуллерен C60 способен взаимодействовать с рецептором фактора роста эпителия (EGFR) и рецептором фактора роста фибробластов (FGFR) [21], влиять на экспрессию белков внеклеточного матрикса панцитокератинов [20] и модулировать иммунный ответ [75,76]. Здесь мы могли бы предположить множественность механизмов действия фуллерена С60, которые могли бы способствовать (по нашему мнению) его существенному противовоспалительному и антифибротическому эффекту из-за множественности клеточных мишеней и, следовательно, способов действия. Кроме того, полученные результаты противовоспалительного, антифибротического и гепатопротекторного действия C60FAS соответствуют нашим предыдущим исследованиям [8,9,20,21,77]. Важно отметить, что C60FAS является относительно безопасным веществом: мы не наблюдали каких-либо изменений жизненно важных органов (печени, почек, селезенки, поджелудочной железы) или других признаков острой или подострой токсичности у животных, получавших C60FAS в течение 7 недель. Более того, было установлено, что максимально переносимая доза фуллерена C60 составляет 721 мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам [13], и какие-либо существенные нарушения проявлялись при дозе C60FAS 150 мг/кг, что значительно ниже той, которая использовалась в нашем эксперименте.

Полученные данные о противовоспалительном, антифиброзном, противоопухолевом и гепатопротекторном действии фуллерена С60 позволяют нам предложить эту наночастицу в качестве перспективного терапевтического средства для коррекции злокачественных новообразований печени. Механизмы биологической активности фуллерена С60, по-видимому, не ограничены его способностью поглощать свободные радикалы. Однако они могут включать цитостатическую активность в отношении неопластических клеток, способность снижать регуляцию G6PD, влиять на экспрессию белков внеклеточного матрикса и р53 и взаимодействовать с EGFR и FGFR.


5. Выводы
Таким образом, была продемонстрирована способность фуллерена C60 при введении в виде водного коллоидного раствора ингибировать фиброзную и раковую дегенерацию и метастазирование и улучшать выживаемость животных на модели ГЦК крыс, индуцированной DEN + CCl4. Это действие фуллерена С60 может быть реализовано благодаря его антиоксидантным свойствам, то есть способности нормализовать окислительно-восстановительное состояние печени и цитостатической активности в отношении злокачественных клеток. Способность фуллерена C60 усиливать экспрессию p53 и подавлять G6PD может способствовать последнему.


Дополнительные материалы
Следующие данные доступны онлайн по адресу https://www.mdpi.com/1999-4923/12/9/794/s1, Рисунок S1. Репрезентативная печень крыс через 54 недели от начала эксперимента, A―ГЦК; B―ГЦК + 5FU; C―ГЦК + C60FAS; D― метастазы в поджелудочную железу (группа 5FU). Фигура S2. Репрезентативная печень здоровых крыс, получавших C60FAS во время умерщвления (А) и окрашивания ткани печени H &E, увеличение ×100 (Б), масштаб 200 мкм, и ×400 (В), масштаб 100 мкм. Рисунок S3. Микрофотографии селезенки крысы, окрашивание H & E, увеличение ×100 (A, C, E, G, I), масштаб 200 мкм, и ×400 (B, D, F, H,J), масштаб 100 мкм: A, B―контроль; C, D―C60FAS; E, F―HCC; G, H―HCC + 5FU; I,J―HCC + C60FAS. Рисунок S4. Микрофотографии почки крысы (A, C, E, G, I) и поджелудочной железы (B, D, F, H, J), окрашивание H & E, увеличение ×400, масштаб 100 мкм: A, B―контроль; C, D―C60FAS; E,F―ГЦК; G, H―ГЦК + 5FU; I,J―ГЦК + C60FAS.

Администрация сайта не несёт ответственности за информацию из сторонних источников. А предоставляет эту информацию для ознакомления пользователями сведениями из открытых источников для повышения знаний и расширения своего кругозора (эрудированности), с целью принятия своего личного решения принимать эти знания или нет.

Made on
Tilda