MDA и PCG ткани печени имели тенденцию к повышению (в 3,7 и 3,9 раза соответственно), что свидетельствует об окислительном стрессе. Однако активность антиоксидантных ферментов и GSH также увеличились (в 1,9–7,7 раза) (Табл. 3), что может быть признаком адаптации опухоли к окислительному стрессу и довольно типично для ГЦК [43,44].
Печень животных с ГЦК, получавших 5FU, в значительной степени соответствовала печени необработанных животных и демонстрировала множественные светлые узлы разного размера и признаки цирроза. Цвет печени был светлым (желтоватым) или темным (рис. 5). Микроскопические исследования, однако, выявили значительное уменьшение цирротических изменений (на 40% по шкале Ишака): межпортальные перегородки были тонкими с неизмененной архитектурой ткани печени между ними, часто фиброзное разрастание ограничивалось только портальными участками. Тем не менее, также имели место эозинофильные изменения гепатоцитов, признаки портальной гипертензии, очаговой узловой гиперплазии и аденомы (рис. 5). Уровни конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови у крыс с ГЦК + 5FU были ниже по сравнению с животными с ГЦК без лечения (на 43% и 32% соответственно), оставаясь, однако, выше, чем в контроле (на 56% и 49% соответственно). АСТ и ГГТ оставались повышенными, активность α-амилазы снижалась (на 55%) (таблица 2). Уровни PCG и MDA печени у крыс с ГЦК + 5FU были снижены по сравнению с крысами с ГЦК, не получавшими лечения (на 41% и 53% соответственно, оставаясь повышенными по сравнению с контролем на 130% и 72%), а также ферменты антиоксидантной защиты и GSH (на 36-89% по сравнению с необработанными животных, изменились незначительно по сравнению с контролем) (таблица 3). Наблюдаемые изменения могут свидетельствовать о нормализации окислительно-восстановительного состояния печени после лечения 5FU, что, вероятно, связано с общим улучшением состояния органа. Поджелудочная железа, почка и селезенка были без существенных изменений, о чем свидетельствует гистологическое исследование (рисунки S3 и S4).
Печень крыс, получавших C60FAS, у которых наблюдался ГЦК, была увеличена, желтоватая, с гладкими краями. Наблюдались признаки фиброза, проявляющиеся одиночными или множественными мягкими узлами (рис. 5). Микроскопическое исследование продемонстрировало значительное подавление цирротических изменений (на 35% по шкале Ишака): межпортальные перегородки были тонкими с неизмененной архитектурой ткани печени между ними, часто фиброзное разрастание ограничивалось только портальными участками без соединительных мостиков. Однако также имели место очаги эозинофильных и базофильных изменений и признаки портальной гипертензии (рис. 5). Уровень конъюгированного и неконъюгированного билирубина в сыворотке крови у крыс HCC + C60FAS был выровнен (в отличие от группы 5FU). АСТ оставался повышенным у животных с ГЦК. ГГТ у крыс с ГЦК + C60FAS также был выше, чем в контроле (в 4 раза); однако он имел тенденцию к снижению по сравнению с группой с ГЦК. Мы обнаружили увеличение уровня триглицеридов в сыворотке крови по сравнению как с контрольной, так и с ГЦК-группой (в 2,8 и 3,16 раза соответственно), а также снижение уровня α-амилазы (на 90%) у животных с ГЦК, получавших C60FAS (таблица 2). Последнее может быть связано с неблагоприятным воздействием С60 на поджелудочную железу и нарушениями углеводного обмена. Однако в структурах поджелудочной железы, почек и селезенки не наблюдалось существенных изменений (рисунки S3 и S4). Животные, получавшие HCC + C60FAS, а также животные, получавшие HCC + 5FU, продемонстрировали снижение MDA и PCG (на 74% и 27% соответственно) по сравнению с крысами, не получавшими HCC. MDA нормализовался, тогда как PCG оставался повышенным в 2,8 раза по сравнению с контролем. Маркеры антиоксидантной защиты у крыс с HCC + C60FAS были выровнены (и снижены по сравнению с группой с HCC на 57-82%) (таблица 3). Следовательно, введение C60FAS способствовало нормализации окислительно-восстановительного состояния печени.
Идти к:
4. Обсуждение
Мы показали, что фуллерен С60 оказывает вероятное цитостатическое действие на клетки HepG2, увеличивает пул апоптотических клеток дозозависимым образом и усиливает экспрессию проапоптотического белка р53. Поскольку р53 является одним из основных проапоптотических белков, а фуллерен С60, как было показано, индуцирует экспрессию р53 [45], мы предполагаем, что сверхэкспрессия р53 может способствовать цитостатическому эффекту фуллерена С60 на клетки HepG2 посредством индукции апоптоза. Однако при применении в дозах менее 10-20 мкг/мл (в зависимости от клеточной линии) фуллерен С60 не увеличивал количество апоптотических и предапоптотических клеток [46], являясь, следовательно, относительно малотоксичным. Низкая цитотоксичность фуллерена С60 в отношении нормальных и неопластических клеток была также продемонстрирована в работах [13,47]. Таким образом, фуллерен C60 не влиял на жизнеспособность лейкозных клеток при применении в дозах 3,6–144 мкг/мл (клетки CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16), IC50 для клеток HEK293 был равен 383,4 мкг/мл.
Удивительно, но, несмотря на развитие фиброза и ГЦК и уменьшение метастазирования in vivo, мы наблюдали повышенную экспрессию виментина в клетках HepG2, вызванную C60FAS. Известно, что повышенная регуляция виментина является маркером эпителиально-мезенхимального перехода, который указывает на увеличение способности опухолевых клеток мигрировать и инвазировать и, следовательно, способности опухоли к метастазированию [48]. Более того, активированные звездчатые клетки печени при фиброзе печени характеризуются сверхэкспрессией виментина, что указывает на их мезенхимальный фенотип [49]. В то же время было показано, что клетки HepG2 при воздействии липополисахарида обнаруживают повышенную экспрессию и расщепление виментина, а также повышенную скорость апоптоза [50]. Кроме того, в работе [51] была показана повышенная экспрессия виментина в облученных ультрафиолетом фибробластах кожи с последующим усилением апоптоза клеток, и в качестве стимулов этого был предложен запускаемый каспазой протеолиз виментина. Кроме того, в исследовании [52] было описано участие виментина в апоптозе клеток, индуцированном фактором некроза опухоли-α. Более того, Li et al. [53] сконструировали клетки HepG2, высоко экспрессирующие виментин, и наблюдали снижение жизнеспособности и инвазивности клеток. Поскольку они оценивали только долю живых клеток, возможно, что усиленный клеточный апоптоз способствует снижению количества клеток. Мы обнаружили, что C60FAS индуцирует апоптоз в клетках HepG2, поэтому мы можем предположить, что повышенная регуляция виментина может быть связана с этим. Поскольку C60FAS при применении при ГЦК ингибирует развитие опухоли и метастазирование, мы могли бы предположить, что фуллерен C60 вряд ли индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход in vivo (по крайней мере, при применении в тестируемой дозе в течение 7 недель), а скорее вызывает апоптоз опухолевых клеток. Более того, принимая во внимание, что фуллерен С60 ингибирует прогрессирование фиброза печени, мы могли бы предположить, что он вряд ли способствует активации звездчатых клеток печени, но вместо этого может подавлять их жизнеспособность. Кроме того, способность фуллерена С60 ингибировать фиброз и цирроз печени была продемонстрирована в наших предыдущих результатах [20,21]. Между тем, полученные результаты in vitro противоречивы и требуют дальнейшего изучения.
Согласно нашим данным, фуллерен C60 ингибировал активность G6PD в клетках HepG2 вплоть до почти полного блокирования дозозависимым образом. G6PD является первым и ключевым ферментом, контролирующим скорость пентозофосфатного пути (PPP), который обеспечивает рибозу и NADPH, поддерживающие биосинтез и антиоксидантную защиту [54]. Таким образом, G6PD высоко экспрессируется в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Подавление активности этого фермента приводит к ингибированию пролиферации клеток и их апоптотической гибели, особенно в условиях окислительного стресса. Вот почему угнетение G6PD является одной из потенциальных стратегий ингибирования роста опухоли и преодоления лекарственной устойчивости [55]. Поскольку ингибирование G6PD является наиболее ярким событием по сравнению с другими наблюдаемыми биохимическими изменениями в клетках HepG2 после культивирования с C60FAS, мы можем предположить, что изменения окислительно-восстановительного баланса, а именно увеличение MDA и снижение CAT, GST, GP и GSH, могут быть следствием нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза клеток HepG2. Однако мы предполагаем, что способность фуллерена C60 ингибировать активность G6PD вносит значительный вклад в цитостатическое действие наночастицы, которое происходит не за счет индукции окислительного стресса, а за счет депривации продукта PPP. Действительно, если мы сравним влияние C60FAS на окислительно-восстановительное состояние клеток HepG2 и HCC-животных и примем во внимание, что для опухолевых клеток характерен незначительный окислительный стресс, мы наблюдаем сходные изменения в окислительно-восстановительных маркерах. В обоих случаях были снижены продукты перекисного окисления липидов и белков, а также активность ферментов антиоксидантной защиты и содержание GSH. Последнее становится ясным, когда мы вспоминаем, что система антиоксидантной защиты в раковых клетках сверхактивируется в ответ на стресс [43,44], что согласуется с нашими результатами in vivo. Таким образом, как in vitro, так и in vivo C60FAS, вероятно, изменяет окислительно-восстановительное состояние на “нормальное” и неопухолевое: подавляет перекисное окисление липидов и уменьшает вызванную стрессом сверхактивацию антиоксидантных ферментов. Однако, несмотря на то, что активность СОД была восстановлена до контрольной в исследовании in vivo, результаты in vitro продемонстрировали значительное повышение активности фермента. Это может быть объяснено вероятным различным воздействием фуллерена С60 на изоферменты СОД. Таким образом, Cu/ZnSOD преимущественно локализован в цитозоле и необходим для регуляции цитоплазматического H2O2. Напротив, MnSOD является митохондриальным ферментом и необходим для поддержания целостности и функций митохондрий, а также для поддержания метаболического переключения с митохондриального дыхания на гликолиз (эффект Варбурга) [56]. В работе [57] авторы объяснили наблюдаемую способность C60FAS уменьшать сверхактивацию MnSOD за счет стабилизации митохондриальной мембраны и, таким образом, предотвращения “утечки” MnSOD из митохондрий в цитозоль. Поскольку мы оценили общую активность СОД в гомогенате клеток HepG2 и цитозольной фракции печени ГЦК (после отделения большей части митохондрий), мы могли бы предположить, что наблюдаемое общее снижение СОД в образцах ГЦК является результатом сохранения MnSOD в митохондриях и, таким образом, его удаления из тестируемых супернатантов. Однако эта тема нуждается в дальнейшем исследовании.
Мы продемонстрировали ослабление повреждения печени вследствие действия C60FAS и значительное подавление ее фиброзной дегенерации на модели ГЦК in vivo и отсутствие признаков токсичности в отношении других жизненно важных органов (почек, селезенки). Однако C60FAS может влиять на функцию поджелудочной железы, о чем свидетельствуют показатели α-амилазы и триглицеридов в сыворотке крови. Стоит отметить, что неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) часто сопровождает недостаточность поджелудочной железы; более того, низкий уровень α-амилазы в сыворотке крови в значительной степени связан с НАЖБП независимо от сопутствующих патологий [58,59]. Таким образом, поджелудочную железу можно рассматривать как орган, наиболее чувствительный к фуллерену С60, что согласуется с нашими предыдущими исследованиями [20], и поэтому должно быть тщательно проанализировано при исследовании биологической активности этой наночастицы.
Известно, что хроническое воспаление, сопровождающееся избыточной выработкой АФК и угнетением системы антиоксидантной защиты и, следовательно, окислительным стрессом, лежит в основе подавляющего большинства заболеваний печени, включая фиброз, цирроз и неоплазию [6,60]. Действительно, было показано, что многие антиоксиданты подавляют как хроническое воспаление печени, так и его последствия, включая фиброз, цирроз печени и неоплазию [61]. Они могли бы реализовывать свою активность посредством прямого удаления АФК или модуляции АФК-зависимых сигнальных путей, включая предотвращение и усиление АФК [62], ингибирование NADPH-оксидаз [63], Wnt [64], NF-κB [65] и передачу сигналов цитокинов [66,67], активацию системы антиоксидантной защиты [68]. Однако часто бывает трудно определить конкретный механизм действия химического вещества, поскольку в большинстве случаев действие антиоксидантов является сложным и включает как поглощение АФК, так и модуляцию одного или нескольких АФК-зависимых сигнальных путей. Более того, часто антифибротическая или противовоспалительная активность вещества напрямую не связана с подавлением АФК-зависимой передачи сигналов. Однако оно влияет на окислительно-восстановительное состояние клеток из-за тесной взаимосвязи с многочисленными другими сигналами. Например, было показано, что ингибиторы рецепторов фактора роста проявляют противовоспалительную и антифибротическую активность, а также проявляют антиоксидантную [69,70]. Хотя доказанных антифибротических средств не существует, проводятся многочисленные исследования с целью выявления новых и установления антифибротической активности для популярных методов лечения заболеваний печени, сопровождающихся ее фиброзной дегенерацией [71]. Множество исследований выявили профилактический эффект природных антиоксидантов против ГЦК [72,73]. Однако простые поглотители свободных радикалов продемонстрировали недостаточную эффективность, вероятно, из-за компенсаторных систем клеток и сложной сети сигнальных путей, предназначенных для обеспечения выживания и пролиферации опухолевых клеток. Следовательно, внимание должно быть сосредоточено на соединениях, влияющих на провоспалительные, апоптотические, выживающие и пролиферативные сигнальные пути в дополнение к прямой антиоксидантной активности [72]. Действительно, было показано, что фуллерен C60 обладает мощной антиоксидантной активностью из-за удаления свободных радикалов [74,75], а также может модулировать экспрессию p53 и активность G6PD и индуцировать апоптоз при применении в относительно высоких дозах. Более того, было показано, что фуллерен C60 способен взаимодействовать с рецептором фактора роста эпителия (EGFR) и рецептором фактора роста фибробластов (FGFR) [21], влиять на экспрессию белков внеклеточного матрикса панцитокератинов [20] и модулировать иммунный ответ [75,76]. Здесь мы могли бы предположить множественность механизмов действия фуллерена С60, которые могли бы способствовать (по нашему мнению) его существенному противовоспалительному и антифибротическому эффекту из-за множественности клеточных мишеней и, следовательно, способов действия. Кроме того, полученные результаты противовоспалительного, антифибротического и гепатопротекторного действия C60FAS соответствуют нашим предыдущим исследованиям [8,9,20,21,77]. Важно отметить, что C60FAS является относительно безопасным веществом: мы не наблюдали каких-либо изменений жизненно важных органов (печени, почек, селезенки, поджелудочной железы) или других признаков острой или подострой токсичности у животных, получавших C60FAS в течение 7 недель. Более того, было установлено, что максимально переносимая доза фуллерена C60 составляет 721 мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам [13], и какие-либо существенные нарушения проявлялись при дозе C60FAS 150 мг/кг, что значительно ниже той, которая использовалась в нашем эксперименте.
Полученные данные о противовоспалительном, антифиброзном, противоопухолевом и гепатопротекторном действии фуллерена С60 позволяют нам предложить эту наночастицу в качестве перспективного терапевтического средства для коррекции злокачественных новообразований печени. Механизмы биологической активности фуллерена С60, по-видимому, не ограничены его способностью поглощать свободные радикалы. Однако они могут включать цитостатическую активность в отношении неопластических клеток, способность снижать регуляцию G6PD, влиять на экспрессию белков внеклеточного матрикса и р53 и взаимодействовать с EGFR и FGFR.
5. Выводы
Таким образом, была продемонстрирована способность фуллерена C60 при введении в виде водного коллоидного раствора ингибировать фиброзную и раковую дегенерацию и метастазирование и улучшать выживаемость животных на модели ГЦК крыс, индуцированной DEN + CCl4. Это действие фуллерена С60 может быть реализовано благодаря его антиоксидантным свойствам, то есть способности нормализовать окислительно-восстановительное состояние печени и цитостатической активности в отношении злокачественных клеток. Способность фуллерена C60 усиливать экспрессию p53 и подавлять G6PD может способствовать последнему.
Дополнительные материалы
Следующие данные доступны онлайн по адресу https://www.mdpi.com/1999-4923/12/9/794/s1, Рисунок S1. Репрезентативная печень крыс через 54 недели от начала эксперимента, A―ГЦК; B―ГЦК + 5FU; C―ГЦК + C60FAS; D― метастазы в поджелудочную железу (группа 5FU). Фигура S2. Репрезентативная печень здоровых крыс, получавших C60FAS во время умерщвления (А) и окрашивания ткани печени H &E, увеличение ×100 (Б), масштаб 200 мкм, и ×400 (В), масштаб 100 мкм. Рисунок S3. Микрофотографии селезенки крысы, окрашивание H & E, увеличение ×100 (A, C, E, G, I), масштаб 200 мкм, и ×400 (B, D, F, H,J), масштаб 100 мкм: A, B―контроль; C, D―C60FAS; E, F―HCC; G, H―HCC + 5FU; I,J―HCC + C60FAS. Рисунок S4. Микрофотографии почки крысы (A, C, E, G, I) и поджелудочной железы (B, D, F, H, J), окрашивание H & E, увеличение ×400, масштаб 100 мкм: A, B―контроль; C, D―C60FAS; E,F―ГЦК; G, H―ГЦК + 5FU; I,J―ГЦК + C60FAS.