Абстрактный
Идиопатический легочный фиброз (ИПФ) представляет собой хроническую прогрессирующую фиброзную интерстициальную пневмонию. И дисбаланс окисления/антиоксидантной защиты играет важную роль в развитии ИПФ. Фуллерен считается новым “структурным” антиоксидантом. Целью этого исследования было выяснить, может ли водорастворимый C60 (C60(OH)22) проявлять антифибротическую активность в своей антиоксидантной роли.

Методы
Здоровых мышей C57BL/6J случайным образом сгруппировали и индуцировали легочный фиброз интратрахеальной инъекцией блеомицина.

Результаты
Наблюдали за выживаемостью мышей и обнаружили, что оптимальной дозой водорастворимого С60 при легочном фиброзе является 10 мг/кг. Мы обнаружили, что водорастворимый С60 может облегчить тяжесть легочного фиброза, наблюдая за компьютерной томографией грудной клетки, легочной патологией и содержанием коллагена, альфа-актина гладких мышц и фибронектина в легких. По сравнению с группой блеомицина, ROS, содержание TNF-α в BALF и количество фибробластов было значительно снижено, а количество альвеолярных эпителиоцитов типа Ⅱ было увеличено после обработки C60.

Вывод
Следовательно, благодаря своему мощному антиоксидантному действию водорастворимый С60 может уменьшить тяжесть легочного фиброза, индуцированного блеомицином у мышей.

Ключевые слова: легочный фиброз, блеомицин, водорастворимый С60, мыши
Идти к:
Вступление
Идиопатический легочный фиброз (ИПФ) определяется как специфическая форма хронической прогрессирующей фиброзирующей интерстициальной пневмонии с неизвестными причинами. Медиана выживаемости пациентов с ИПФ составляет 2-3 года с момента постановки диагноза при 5-летней смертности 30-50%. Эффективной терапии, кроме трансплантации легких, не существует.1 Кроме того, срочно необходимы новые сильнодействующие препараты.

Патогенетические механизмы ИПФ остаются неясными. В настоящее время считается, что ИПФ возникает в результате аномального восстановления альвеолярного эпителия после повторного незначительного повреждения, что приводит к образованию рубцов и разрушению легочной ткани.2 За последние несколько лет было обнаружено, что дисбаланс окисления/антиоксидантной защиты играет важную роль в прогрессировании ИПФ.3 Снижение окислительного стресса может снизить степень легочного фиброза.4

Окислительный стресс - это дисбаланс между окислителями, такими как активные формы кислорода (АФК), и антиоксидантами, которые могут влиять на липиды, ДНК, углеводы и белки. АФК - это свободные радикалы, образующиеся физиологически в процессе окислительного фосфорилирования, включая супероксид-анион, гидроксил и перекись водорода. Он играет различные физиологические роли, такие как вызывание клеточной дисфункции и гибели. Исследования показали, что оксиданты и миелопероксидаза клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) увеличивались до более высокой концентрации у пациентов с IPF,5 и повреждение эпителия при IPF было связано с повышением активности пероксидазы. Даниил и соавт. определили окислительную нагрузку в сыворотке крови на основе анализа гидропероксидов6 и обнаружили, что уровень системного окислительного стресса при ИПФ был значительно выше, чем в контроле, и отрицательно коррелировал с тяжестью одышки и функцией легких, отмеченной форсированной жизненной емкостью и диффузной емкостью легких для монооксида углерода. Таким образом, дисбаланс окисления/антиоксидантной защиты связан с прогрессированием идиопатического легочного фиброза.

Фуллерен считался новым “структурным” антиоксидантом и был охарактеризован Krusic et al. как “губка для радикалов”7. Водорастворимый фуллерен С60 нетоксичен при низких физиологических концентрациях8,9, который способен проникать через мембрану клетки10,11 и обладает сильными антиоксидантными свойствами.8 Кроме того, было обнаружено, что фуллерен С60 обладает противоопухолевой активностью.12,13

В этом исследовании мы стремились выяснить, может ли водорастворимый C60 (C60(OH)22) проявлять антифибротическую активность в мышиной модели блеомицин-индуцированного фиброза легких благодаря своей антиоксидантной роли.


Материалы и методы
Животные
Мышей C57BL/6J, не содержащих специфических патогенов (SPF), приобрели в Центре животных Пекинского университета (Пекин, Китай) и кормили в условиях SPF в Центре фундаментальных медицинских исследований Пекинской больницы Чаоян, входящей в состав Столичного медицинского университета. Мышей–самцов в возрасте 7-8 недель и весом 22-25 г использовали для лечения блеомицин-индуцированного фиброза легких у мышей. Уход и использование лабораторных животных в этом исследовании строго соответствовали руководству Национального института здравоохранения. Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Столичного медицинского университета (AEEI-2014-034).

Получение водорастворимого С60 и Пирфенидона
C60(OH)22 с чистотой более 99,9% был получен от Suzhou Dade Carbon Nanotechnology Co., Ltd. C60(OH)22 растворяли в стерилизованном и апирогенном физиологическом растворе (0,9%). Пирфенидон был приобретен у Beijing Continent Pharmaceutical Co. Ltd.

Дизайн эксперимента
Животные были случайным образом разделены на 10 групп следующим образом.

Для изучения профилактических эффектов существуют 1) группа NS (обычный физиологический раствор) – мыши получали только физиологический раствор; 2) группа BLM – мыши получали BLM, лечение –физиологический раствор (в день); 3) группа 1 мг/кг – мыши получали BLM, лечение–C60(OH)22 1 мг/кгкг/сут; 4) группа 10 мг/кг – мыши получали BLM, лечение–C60(OH)22, 10 мг/кг/сут; 5) группа 100 мг/кг – мыши получали BLM, лечение–C60(OH)22, 100 мг/кг/сут; 6) 500 группа мг/кг –мыши получали BLM, лечение–C60(OH)22, 500 мг/кг/сут.

Для изучения терапевтических эффектов существуют 1) группа NS – мыши получали только физиологический раствор; 2) группа BLM – мыши получали BLM, лечение –физиологический раствор (в день); 3) группа BLM + C60 – мыши получали BLM, лечение–C60(OH)22 10 мг/кг/сут; 4) Группа BLM + пирфенидон – мыши получали BLM, лечение –пирфенидон 300 мг/кг/сут.

Всем мышам (кроме группы NS) вводили однократную интратрахеальную инъекцию 3,5 (профилактическая) или 2,0 (терапевтическая) мг/кг массы тела гидрохлорида BLM, разведенного физиологическим раствором.14 C60(OH)22 и пирфенидон вводили внутрибрюшинно, начиная с первого дня (профилактическая) и 14-го дня (терапевтическая) до тех пор, пока мышей не умерщвляли через 21 день (профилактический) и 28 дней (терапевтический) после интратрахеальной инъекции BLM (рис. 1). Кроме того, кровь, жидкость для бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и легочную ткань собирали, как описано ранее,15 левое легкое фиксировали 10%-ным раствором формальдегида, правое легкое замораживали при температуре -80°C для использования.

Гистологическое исследование легких
Забор легких мыши для гистологического исследования проводился в качестве обычной процедуры.16 Вкратце, легкое фиксировали (10% раствором формальдегида), обезвоживали, заливали парафином и разрезали на срезы толщиной 4 мкм. Срезы легких окрашивали H&E и трихромной краской Массона для оценки патологических изменений.17 Иммуноокрашивание проводили с использованием антител к коллагену I (Abcam, Кембридж, США), поверхностно-активному белку C (Abcam, Кембридж, США) и антителу к альфа-гладким мышцам (α-SMA) (Abcam, Кембридж, США).

Анализ на гидроксипролин
Содержание гидроксипролина в легких измеряли обычными методами.18 Содержание гидроксипролина рассчитывали на основе массы легкого, и данные выражали в микрограммах гидроксипролина в каждом грамме легочной ткани.

ИФА
Концентрации TGF-β1 и TNF-α в легочной ткани, BALF и плазме определяли с помощью наборов для ИФА (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Экстракция белка и вестерн-блот-анализ
Замороженные ткани легких гомогенизировали с использованием буфера RIPA (Solarbio, Пекин, Китай), содержащего фенилметилсульфонилфторид (PMSF) в соотношении 1:100 и ингибиторы фосфатазы. Общую концентрацию белка ресуспендировали в буфере для загрузки белка, содержащем 5% меркаптоэтанола. Белки разделяли с помощью 8%-ного электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, США) с использованием модуля электрофореза Mini-Protean (Bio-Rad) при 80 мВ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, Биллерика, Массачусетс, США) для 100 мин с использованием переносной ячейки для электрофореза Mini Trans-Blot (Bio-Rad) при 300 мА. Мембраны обрабатывали анти-кроличьим или анти-мышиным IgG (LI-COR, Линкольн, Северная Каролина, США). Визуализировали положительные полосы и оценивали интенсивность полос с помощью LI-COR Odyssey. В качестве первичных антител использовались антитела к фибронектину (Abcam, Кембридж, США), антитела к α-SMA (Abcam, Кембридж, США) и антитела к β-актину (Abcam, Кембридж, США).

Анализ выживаемости
Мы провели анализ выживаемости в каждой профилактической группе (n=9-10). Время выживаемости каждой мыши регистрировали до 21-го дня после введения BLM или физиологического раствора.

Измерение концентрации АФК
Содержание АФК измеряли с использованием DCFH-DA в соответствии с инструкциями производителя, который был приобретен в Нанкинском институте биоинженерии Цзяньчэн.

Статистический анализ
Все данные были выражены в виде среднего значения ± SD. Все эксперименты проводились с тремя независимыми повторениями. GraphPad Prism 6 (GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния, США) использовался для статистического анализа с использованием t-критерия или одностороннего дисперсионного анализа; считалось, что P < 0,05 указывает на статистически значимые различия во всех сравнениях.

Идти к:
Результаты
Оптимальная доза C60(OH)22 при легочном фиброзе составляла 10 мг/кг/сут
Время выживания Смертность имела значительную разницу между группами, получавшими профилактику. Все мыши в группе NS прожили 21 день. Однако в группе BLM была продемонстрирована значительная смертность мышей, и наблюдалось значительное изменение медианного времени выживаемости между группой, получавшей C60(OH)22 в дозе 10 мг/кг/сут, и группой BLM (рис. 2А). До 21-го дня выжили 30% мышей в группе BLM, 44,4% в группе C60(OH)22 в дозе 1 мг/кг и 100 мг/кг, 66,7% в группе 10 мг/кг, и ни одна мышь не выжила в группе 500 мг/кг. Эти результаты показали, что C60(OH)22 мог защитить мышей от смерти, когда мышей лечили дозой 10 мг/кг/сут и 1 мг/кг/сут, но мыши, получавшие C60(OH)22 в дозе 100 мг/кг/сут, не имели различий с Более того, в группе BLM C60(OH)22 в дозе 500 мг/кг/сут был вреден, но не приносил пользы.

Масса тела Масса тела мышей в профилактических группах (за исключением группы NS) значительно снизилась. Однако, по сравнению с группой BLM, у мышей в группе 10 мг/кг наблюдалось небольшое снижение, но разница не была существенной (рисунок 2B).
C60(OH)22 оказывал терапевтический эффект на поздних стадиях индуцированного BLM легочного фиброза
Изображения компьютерной томографии легких мышей Изображения компьютерной томографии легких мышей на 28-й день после введения BLM или физиологического раствора показаны на рисунке 2A. Легкие в группах BLM демонстрировали некоторые консолидированные тени по сравнению с группой NS (рисунок 3A). Однако, по сравнению с группой BLM, изображения легких в группе BLM+C60 выявили снижение плотности и диффузные помутнения матового стекла с участками уплотнения или без них (рис. 3А), но количественная оценка была затруднена.

Повреждение легких, вызванное H&E и MASSON BLM, и фиброз у мышей контролировали с помощью гистопатологического анализа. Было показано, что инстилляция BLM вызывала значительное увеличение фиброза в легком на срезах, окрашенных H&E. Мыши с фиброзом, индуцированным BLM, продемонстрировали повышенную деформацию легочной паренхимы, демонстрируя более толстую альвеолярную мембрану, разрушенные альвеолы и инфильтрацию воспалительными клетками (рис. 3А). Окрашивание коллагена трихромом Массона было использовано для демонстрации того, что BLM индуцировал сильное отложение коллагена у мышей. Однако введение C60(OH)22 и пирфенидона заметно облегчало повреждения легких и, очевидно, уменьшало отложение коллагена (рис. 3А).
Гидроксипролин Гидроксипролин был сконцентрирован в воспалительной реакции, вызванной BLM, и наблюдалась положительная корреляция между уровнем гидроксипролина и коллагена. Как проиллюстрировано (рис. 3С), содержание гидроксипролина было значительно увеличено после введения BLM, в то время как после лечения C60(OH)22 и пирфенидоном оно обратилось вспять.
Коллаген I, α-SMA и фибронектин Впоследствии мы исследовали способность C60(OH)22 модулировать экспрессию коллагена I, α-SMA и фибронектина, которые являются ключевыми маркерами легочного фиброза. Результаты показали, что в тканях легких мышей, получавших BLM, заметно повышалась экспрессия коллагена I, α-SMA и фибронектина (рис. 3А и Б).Б). Впечатляюще, что уровни α-SMA и фибронектина были явно снижены после лечения C60(OH)22 и пирфенидоном (рис. 3B). Экспрессию коллагена I контролировали с помощью иммуногистохимического анализа. Срезы легких мышей в группе NS показали слабое положительное окрашивание коллагена I, в то время как интратрахеальная инстилляция BLM приводила к заметно повышенной экспрессии коллагена I в тканях легких. Введение C60 или пирфенидона в значительной степени снижало экспрессию коллагена I по сравнению с группой BLM (рис. 3A и D).D). Эти результаты непосредственно отражали эффект ослабления C60(OH)22 на BLM-индуцированный фиброз легких у мышей.
Механизмы терапевтического действия C60(OH)22 на индуцированный BLM легочный фиброз
Уровни АФК были определены в легочной ткани с целью изучения влияния C60(OH)22 на окислительный стресс при фиброзе легких, индуцированном BLM (рис. 4А). У животных, получавших BLM, наблюдалось значительное повышение уровня АФК в легочной ткани, в то время как после введения C60(OH)22 оно было обратимым (Р<0,05).

TGF-β1 и TNF-α TGF-β1 и TNF-α играют важную роль в патогенезе и обострении легочного фиброза,19 и мы оценили влияние C60(OH)22 на их экспрессию. Как показано на фиг. 4E и ИФ.,F., экспрессия TGF-β1 и TNF-α в легочной ткани, BALF и плазме была значительно повышена в группе BLM по сравнению с группой NS, в то время как она снижалась после введения C60(OH)22, что позволяет предположить, что C60(OH)22 может ингибировать экспрессия TGF-β1 и TNF-α.
Клетки альвеолярного эпителия AECⅡ и α-SMA типа 2 (aecⅡ) были помечены сурфактантным белком C (SPC) с помощью иммуногистохимии (рис. 4B и А).В). По сравнению с группой NS, участки легких в группе BLM характеризовались значительным снижением количества aecⅡ, в то время как количество снова повысился у мышей, получавших группу С60. α-SMA контролировали иммуногистохимическим методом, чтобы отразить количество фибробластов. Срезы в группе NS показали слабое положительное окрашивание α-SMA, в то время как в группе BLM была показана повышенная экспрессия (рис. 4B и andD).D). Эти результаты непосредственно отражают то, что C60(OH)22 может уменьшать апоптоз AECⅡ и количество фибробластов за счет ослабления окислительного стресса.

Обсуждение
В этом исследовании было обнаружено, что водорастворимый C60 служит антифибротическим средством при индуцированном BLM мышином легочном фиброзе, который использовался в качестве классической модели для оценки антифибротического эффекта.20 Результаты показали, что BLM может индуцировать легочный фиброз и вызывать гибель мышей, потерю массы тела и усугублять гистопатологические аномалии легких с отложением коллагена. Однако эти неблагоприятные последствия, вызванные BLM, были эффективно ослаблены водорастворимым C60. Наше исследование показало, что водорастворимый C60 обладает значительным противовоспалительным и антиоксидантным действием при BLM-индуцированном повреждении легких у мышей. Насколько мне известно, это первый случай обнаружения роли С60, нового “структурного” антиоксиданта, у мышей с фиброзом легких, индуцированным блеомицином.

Во многих исследованиях сообщалось, что окислительный стресс тесно связан с развитием IPF.5,6,21 Избыточная выработка АФК играет ключевую роль в окислительном стрессе, и АФК также является важной средой в процессе легочного фиброза. Было показано, что АФК могут вызывать повреждение и перелом одноцепочечной ДНК, что приводит к повреждению AEC и некрозу. А избыточная выработка АФК может индуцировать апоптоз AEC, активируя путь рецептора смерти 22, путь гибели митохондрий 23 и смерть, связанную с эндоплазматическим ретикулумом.24 Таким образом, стимулируется активация фибробластов и отложение коллагена, а затем прогрессирует легочный фиброз. Наше исследование показало, что водорастворимый С60 может значительно снизить концентрацию АФК в легочной ткани. И мы наблюдали, что водорастворимый C60 может уменьшать апоптоз и/или некроз AEC и снижать активацию фибробластов. Эти результаты позволяют предположить, что развитие IPF было бы подавлено водорастворимым C60.

Кроме того, АФК могли бы регулировать передачу сигнала.25 АФК могут повышать экспрессию TGF-β1, TNF-α, интерлейкина, тромбоцитарного фактора роста Чаудхари и др.26 Среди них TGF-β1 играет ключевую роль в легочном фиброзе, который называют “главным переключателем” фиброза органов (включая легочный фиброз).27 В определенной степени степень воспаления и фиброза зависит от количества TGF-β1.28,29 Апоптоз AEC был опосредован TNF-α. TNF-α, который является важным фактором в процессе легочного фиброза, повышал экспрессию TGF-β1.30 Избыточная экспрессия этих цитокинов усугубляла повреждение и апоптоз клеток и ускоряла развитие легочного фиброза. В то время как было показано, что АФК активируют эти цитокины, и эти цитокины также увеличивают выработку АФК в фибробластах легких человека, таким образом, образуется порочный круг. В нашем исследовании мы наблюдали, что содержание TGF-β1 и TNF-α значительно снизилось в легких мышей после обработки C60(OH)22 по сравнению с группой BLM, что позволяет предположить, что водорастворимый C60 может снижать экспрессию TGF-β1 и TNF-α. Таким образом, в конечном счете, облегчается воспаление и ингибируется фиброз за счет снижения содержания АФК.

ИПФ является хроническим и смертельным заболеванием, и лечение ИПФ является весьма спорным, и не было разработано никакого лечебного средства, за исключением пирфенидона и нинтеданиба. Однако при приеме пирфенидона могут возникать побочные эффекты, такие как желудочно-кишечные симптомы, светочувствительность и утомляемость.31,32 И нинтеданиб замедляли прогрессирование заболевания с такими побочными эффектами, как повышение активности печеночных ферментов, Mazzei и др.33 Однако Гарби и др. показали, что фуллерен С60 является мощным антиоксидантом, не обладающим острой или подострой токсичностью.8,9 Баати и соавт. обнаружили, что продолжительность жизни крыс была бы увеличена при повторном пероральном введении фуллерена С60.34 Следовательно, фуллерен С60, вероятно, станет новым средством лечения ИПФ.